원형질막에서 흘러나온 미세소포는 세포 효과기 역할을 합니다. 비장 미세소포체(SMV)는 병태생리학적 상태의 대리 마커입니다. 쥐와 생쥐에서 SMV 함량 및 특성은 노화 또는 염증을 특징짓고 세포 보호 처리에 의해 변경되어 전임상 연구를 위한 중요하면서도 풍부한 모니터링 도구가 됩니다.
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방법 논문
복강내 세균 감염의 쥐 모델에서 비장 미세소포의 분리(Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection)
이 논문에서
요약
초록
미세소포(Microvesicle, MV)는 활성화된 세포의 원형질막에서 방출되는 서브미크론 단편으로, 전염증성 및 프로응고성 세포 효과기 역할을 합니다. 쥐의 경우, 비장 MV(SMV)는 병태생리학적 상태의 대리 마커입니다. 이전의 시험관 내 연구에서는 주요 치주 병원균인 포르피로모나스 진 지발리스(P. gingivalis)가 내피 탈락 및 세포사멸을 가능하게 하는 반면, 지질다당류(LPS)는 비장 세포 유래 미세소포체(SMV)의 탈락을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 생체 내 연구는 SMV 흘림의 약리학적 제어의 타당성을 보여주었습니다. 본 프로토콜은 P. gingivalis 급성 쥐 감염 모델에서 비장 SMV를 분리하기 위한 표준화된 절차를 수립합니다. P. gingivalis 감염은 어린 C57BL/6 마우스에서 복강내 주사(주당 5 x 107 박테리아 3회 주사)에 의해 유발되었습니다. 2주 후, 비장을 채취하여 무게를 측정하고 비장 세포를 계수했습니다. SMV는 단백질, RNA 및 프로트롬비나제 분석에 의해 분리되고 정량화되었습니다. 세포 생존율은 프로피듐 요오드화물 또는 트리판 블루 배제 염료로 평가되었습니다. 비장세포 추출 후, 비장세포 배양 24시간 후 유세포분석으로 호중구 수를 얻었습니다. P. gingivalis를 주입한 마우스에서는 비장 무게가 2.5배 증가하고 비장 세포 수가 2.3배 증가한 것이 관찰되었으며, 호중구 수는 40배 증가했습니다. P. gingivalis를 주입한 마우스의 비장세포의 세포 생존율은 75%-96% 범위였으며 노출되지 않은 대조군과 비교하여 배양 24시간 후 50% 감소했습니다. 그러나 주입된 마우스의 비장세포는 프로트롬비나제 분석 또는 단백질 측정에 의해 더 많은 양의 MV를 방출합니다. 이 데이터는 procoagulant SMV가 복강내 P. gingivalis 감염에 대한 조기 비장 반응을 평가하는 신뢰할 수 있는 도구임을 보여줍니다.
서론
미세입자(microparticles) 또는 엑토솜(ectosome)이라고도 하는 미세소포(Microvesicles, MV)는 다양한 세포 자극에 반응하여 체액과 세포외 공간에서 방출되는 직경이 0.1-1.0μm인 원형질막 조각입니다. 처음에는 주로 포스파티딜세린(PSer)인 응고성 인지질에 노출되는 혈소판 분진으로 확인된 MV는 혈액 응고 복합체의 조립을 위한 추가 표면을 구성합니다 1,2. procoagulant effector로서 순환 MV의 주요 역할은 기능 장애 PSer 노출 및 출혈을 유발하는 희귀 유전 질환인 Scott syndrome2 환자에서 입증되었습니다(보충 그림 1). MV는 당뇨병, 만성 신장 질환, 자간전증, 고혈압과 같은 심혈관 질환과 관련된 만성 질환에서 혈전 위험의 순환 바이오마커로 광범위하게 연구되어 왔다 3,4. 그들은 현재 심근과 같은 유체 또는 장기 조직에서 진정한 세포 효과기로 인식되고 있습니다
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프로토콜
모든 실험 프로토콜은 지역 윤리 위원회(APAFIS#28745-2020121815051557)와 모교 및 INSERM의 동물 관리의 관련 지침에 의해 승인되고 따랐습니다. 생후 6-8주령의 수컷 Young C57BL/6 마우스를 실험에 사용했습니다. 통증과 스트레스를 평가하기 위해 생쥐를 정기적으로 검사하고 체중을 매일 모니터링했습니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 추출 완충액과 용액은 멸균 상태여야 하며 실온에 있어야 합니다.
1. 동물 준비
- 2주 동안 2일마다 P. gingivalis (PG)를 복강내 6회 주사합니다(주당 5 x 107 박테리아 3회 주사, 보충 파일 1).
- 100mg/kg의 케타민과 10mg/kg의 자일라진을 조합하여 마우스를 마취합니다.
- 마취된 마우스를 희생하고 개복술 후 비장을 수확합니다.
참고: P. gingivalis 의 감염에 대한 구체적인 조건과 비장 채취를 위한 동물의 희생은 보충 파일 1의 "동물 실험" 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. 프로....
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결과
제공된 데이터는 두 가지 주요 동물 상태, 즉 치료되지 않은 어린 C57BL/6 마우스와 그 새끼를 대조군에게 2일마다 2주일 동안 6번의 복강내(IP) PG 주사를 맞았습니다. 그들은 또한 2주 후 비장 반응에 대한 복강내 PG 주사의 원격 작용을 보여줍니다. 비장세포 미세소포는 프로트롬비나제 효소 분석법 또는 분광광도법으로 단백질 및 RNA 농도를 측정하여 정량화하였고, 호중구의 비율은 비장세포 현탁액에서 유세포 분석33,38에 의해 결정되었습니다(보충 파일 1 및 보충 그림 2의 섹션 2-4).
P. gingivalis에 IP 주입 2주 후 비장 중량 및 세포 수 증가
젊은 성인 마우스에서 PG 주사.......
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토론
본 연구는 비장이 생쥐에서 제한된 양의 혈액과 같은 다른 공급원에 비해 생리병리학적 관련성이 있는 MV의 중요하고 신뢰할 수 있는 공급원임을 확인합니다. 예방 조치를 취하면 이 방법을 쉽게 설정할 수 있으며 값비싼 장비가 필요하지 않습니다. 생체 내 평가 이외의 다른 방법이 없기 때문에 현재 모델은 MV 흘림에 대한 친약물의 영향을 연구하는 데 유용한 방법으로 보입니다. 중요한 것은, 여기에 제시된 쥐 비장 미세소포(SMV)를 채취하기 위한 표준화된 프로토콜은 주사 또는 비강 점안 후 조작된 마우스에서 궁극적으로 SMV 매개 효과 제어에 대한 생체 내 연구에 대한 충족되지 않은 요구 사항에 맞아야 한다는 것입니다.
본 방법은 또한 SMV가 P. gingivalis IP 감염과 같은 국소 감염의 원격 영향을 조사하기 위한 관련 전임상 도구임을 보여줍니다. 실제로, 여러 접근.......
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다.
감사의 글
저자는 비장의 복합 유세포 분석 분석에 대한 전문가의 도움과 형성을 제공해 준 Service commun de cytométrie en flux(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg)의 Claudine Ebel과 쥐 비장 세포 라벨링에 대한 초기 교육을 제공한 Ali El Habhab에게 빚을 지고 있습니다. 데니즈 카라교즈는 땅을 파고 출판물을 모으는 일을 도왔습니다. 이 연구는 두 개의 ANR 보조금 COCERP(N°A17R417B), ENDOPAROMP(N°ANR-17-CE17-0024-01)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 튜브 유형 Eppendorf | Dutscher | 54816 | 원뿔형 바닥 sté riel microtubes |
| Allegra 64 R 원심분리기 | Beckman Coulter | ||
| 자동 세포 계수기 | Biorad | ||
| 소 혈청 알부민 | Euromedex | 04-100-812-E | 0.22 µ로 여과 준비; m 체를 거르고 4 °에 저장; 다음 공식을 사용하여 멸균 조건에서의 C: 2 mM EDTA, 0,5% BSA 및 멸균 PBS |
| CD11 (Mac-1) | e-Biosciences | 45-00112-80 | eFluor 450에 접합; λ max 여기 405nm λ max 방출 445 nm |
| CD16/32 | BD Biosciences | 553142 | 비접합 |
| EDTA | Calbiochem | Calbiochem S | 6381-92-6 |
| 팔콘 튜브 | Cell star | 227261 | 50 mL |
| 소 태아 혈청 | Dutscher | S1810-500 | 배치 번호 = S14028S1810 |
| Fortessa Aria | BD Biosciences | for 세포 분류 | |
| Fortessa 유세포 분석기 | Becton-Dickinson. | ||
| Fungizone | PAN biotech | P06-01050 | |
| HBSS | Gibco | 14175-053 | 페놀 레드 없음, Ca+2 및 Mg+2 |
| ICAM-1 | abcam | ab171123 | |
| LYG-6 (Gr-1) | BD Biosciences | 566218 | BUV395에 활용; &람다; max 여기 348 nm, λ max 방출 395 nm |
| 용해 완충액 적혈구 (ACK) | 시그마 | 준비, 0.22 &마이크로로 여과; m 체는 4 °C에 저장한다; 다음 공식을 사용하여 멸균 상태에서 C: NH4Cl, 0.15 M (몰 농도), 53.491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (몰 농도) 100.115 (mw), 50 mg EDTA 0.1 mM (몰 농도), 292.24 (mw), 14.6 g pH: 7.2– 7.4 | |
| NanoDrop 1000 분광 광도계 | Thermoscientific | ||
| PBS | Lonza | 17-516F | Ca+2 및 Mg+2 |
| 플라스틱 페트리 접시 | 100mm | ||
| 폴리스티렌 튜브 | Falcon | 352070 | |
| q-Nano Gold | iZON 과학 | ||
| RPMI 1640 배양 배지: 2g/L 포도 | PAN 생명공학 | p04-18047 | 스트렙토마이신(100 U/mL)/페니실린(100 U/mL), 곰팡이존(250 mg/mL), L-글루타민(2 mM) 및 FBS 10% 보충. |
| 메스 | |||
| 체, 나일론 | 팔콘, 미국 | , 352360 | 100, 마이크로; m |
| 스트렙토마이신/페니실린 | PAN 생명공학 | P06-07100 | |
| 주사기 | 2mL | ||
| 트리판 블루 | 비오라드 | 1450013 | |
| VCAM1 | abcam | ab215380 |
참고문헌
- Loyer, X., et al. Intra-cardiac release of extracellular vesicles shapes inflammation following myocardial infarction. Circulation Research. 123 (1), 100-106 (2018).
- Aupeix, K., Toti, F., Satta, N., Bischoff, P., Freyssinet, J. M.
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