우리는 hSOD1G93A 쥐 모델에서 근 위축성 측삭 경화증의 병태 생리학에 대한 연구를 위해 세포 내Ca 2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 위해 쥐 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 쥐 hSOD1G93A 모델에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)의 병태 생리학을 연구 할 목적으로 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 프로토콜은 출생 후 쥐 피질에서 성상 세포와 미세 아교 세포를 분리 및 배양하는 방법을 보여 주며, 성상 세포의 신경교 섬유 산성 단백질 (GFAP) 마커와 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1) 소교 세포 마커를 사용하여 면역 세포 화학에 의해 이러한 배양의 순도를 특성화하고 테스트하는 방법을 보여줍니다. 다음 단계에서는 배양 된 세포의 염료 로딩 (칼슘 민감성 Fluo 4-AM) 및 살아있는 세포에 대한 비디오 이미징 실험에서 Ca2+ 변화의 기록에 대한 방법을 설명합니다.
비디오 녹화의 예는 다음으로 구성됩니다 : (1) ALS 환자로부터 분리 된 면역 글로불린 G (IgG)에 급성으로 노출 된 배양 된 성상 세포의Ca 2+ 이미징 사례는 동일한 실험에서 입증 된 바와 같이 ATP에 대한 반응과 비교하여 특징적이고 특이적인 반응을 나타낸다. 예는 또한 비 형질 전환 대조군과 비교하여 hSOD1G93A 성상 세포에서 ALS IgG에 의해 유발되는 세포 내 칼슘 농도의 더 뚜렷한 일시적인 상승을 보여줍니다. (2) 소포체Ca2+ ATPase의 비경쟁적 억제제인 타프시가르긴(Thg)에 의한 칼슘 저장고갈 동안 배양된 성상세포의Ca2+ 이미징, 이어서 기록 용액에 칼슘을 첨가하여 유도된 저장 작동식 칼슘 진입, 이는 hSOD1G93A 및 비-형질전환 성상세포에서의Ca 2+ 저장 작업 간의 차이를 입증함; (3) 배양된 미세아교세포의 Ca2+ 영상화는 주로 ALS IgG에 대한 반응의 결여를 나타내는 반면, ATP 적용은Ca2+ 변화를 유도하였다. 이 논문은 또한 Ca2+ 염료 및 염료 로딩 기술의 올바른 농도를 선택하여 중요한 세포 밀도 및 배양 순도와 관련하여 가능한 주의 사항 및 주의 사항을 강조합니다.
서론
세포 배양 기술은 건강 및 질병 분야의 다양한 세포 신경 생리학 분야에서 수많은 발전을 가져 왔습니다. 특히, 실험실 동물의 신경 조직에서 갓 분리 된 1 차 세포 배양을 통해 실험자는 다양한 생화학 적 배지 및 생리 학적 설정에서 다양한 세포의 행동을 면밀히 연구 할 수 있습니다. Ca2+ 민감성 염료와 같은 다양한 형광 생리학적 지표를 타임랩스 비디오 현미경과 함께 사용하면 실시간으로 세포 생물물리학 및 생화학적 과정에 대한 더 나은 통찰력을 얻을 수 있습니다.
ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미치는 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다1. 이 질병은 가족 유형의 복잡한 발병 기전을 가지고 있지만 대부분 산발적 인 형태 (사례의 90 %)2. 비세포 자율 메커니즘이 ALS 병태생리학에 기여한다는 것은 잘 알려져 있으며, 이는 주로 신경교 세포의 필수적인 역할 때문입니다3. ALS는 또한 염증의 체액 성 및 세포 성 요인의 침범과 함께 신경 염증성 질환으로 잘 특성화됩니다.
면역 글로불린 G는 ALS 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 분자 마커....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 실험은 과학적 목적을위한 동물 보호에 관한 EU 지침과 베오그라드 대학교 생물학 학부 윤리위원회 (승인 번호 EK-BF-2016 / 08)의 허가를 받아 수행되었습니다. 환자 물질 (IgGs에 대한 혈청)에 관해서는 인간을 대상으로 한 실험을 위해 세계 의학 협회 윤리 강령 (헬싱키 선언)에 따라 정보에 입각 한 환자의 동의하에 일상적인 임상 검사를 위해 수집되었습니다. 이 프로토콜은 세르비아 임상 센터의 윤리위원회에서 승인되었습니다 (No. 850/6).
1. 1차 세포 배양 제제
- 뇌 조직 분리
알림: 얼음처럼 차가운 용액을 사용하여 얼음 위에서 격리를 수행해야 합니다.- 1차 신생아 세포 배양을 위해 1-3일령의 신생아 새끼를 사용하십시오33.
참고: 여기에 제시된 연구를 위해, Sprague Dawley hSOD1G93A 및 비-형질전환 쥐가 사용되었다. 유전형 분석을 위해, 쥐 꼬리는 나중에 DNA 추출 및 PCR에 사용되었다. - 강아지의 머리에 70 % 에탄올을 뿌리고 즉시 가위를 사용하여 빠르게 참수하십시오.
- 두개골을 노출시키기 위해 작은 각도의 가위로 피부를....
- 1차 신생아 세포 배양을 위해 1-3일령의 신생아 새끼를 사용하십시오33.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
배양에서 다양한 신경교 세포 유형의 특성 분석
실험을 위해 성상 세포를 생산하는 데 보통 15-21 일이 걸리는 반면, 소교 세포는 자라는 데 10-15 일이 걸립니다. 배양물의 세포 순도를 평가하기 위해 면역염색을 수행하였다. 도 1 은 각각의 배양물에서 성상세포 마커 GFAP 및 미세아교세포 마커 Iba1의 이중 표지의 발현을 나타낸 것이다.
칼슘 영상은 건강한 성상 세포와 병든 성상 세포의 세포 생리학의 차이를 드러내는 것으로 알려져 있습니다. 이전에 야생형 성상 세포에서 ALS IgG가 세포 내 및 세포 외 풀을 세포질8로 동원하여 세포 Ca에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다 2+. 다음 프로토콜은 hSOD1G93A의 칼슘 과도 상태와 환자의 ALS IgG 샘플에 급성으로 노출 된 비 형질 전환 배양 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 논문은 쥐 hSOD1G93A 모델에서 ALS와 같은 세포(patho)생리학의 다양한 측면을 연구하기 위한 빠르고 "예산에 맞는" 도구로서 일차 세포 배양 방법을 제시합니다. 따라서이 기술은 더 높은 수준의 조직 (즉, 조직 조각 또는 살아있는 동물)에서 외삽되고 추가로 조사 될 수있는 단일 세포 수준의 연구에 적합합니다. 그러나 기술로서의 세포 배양에는 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 얼음 위에서 뇌 조직 분리 및 세포 해리를 수행하고 가능한 한 최단 시간에 이러한 단계와 후속 분리 및 준비 단계를 수행하는 것이 가장 중요합니다. 오염은 잘 멸균된 장비를 사용하고 층류 후드(37)에서 조직 해리를 수행하는데 특히 주의를 기울임으로써 극복될 수 있는 항상 존재하는 장애물이다. 세포의 정확한 밀도를 심는 것도 중요합니다. 파종된 세포의 수가 원하는 수보다 적으면 접시에서 세포 성장 및 번식을 지원하지 않습니다. 그러나 세포가 너무 조밀하면 성장 배지의 영양소에 대한 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 세르비아 공화국 교육 과학 기술 개발부 계약 번호 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS 교육 및 훈련 클러스터 프로젝트 "신경염증의 신경교세포에 대한 삼자 과정" 및 EC H2020 MSCA RISE 보조금 #778405의 지원을 받았습니다. 면역조직화학 이미지를 제공해 주신 Marija Adžić와 Mina Perić, 논문 작성에 도움을 주신 Danijela Bataveljić에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15mL 튜브 | Sarstedt, 독일 | 62 554 502 | |
| 2mL 튜브 | Sarstedt, 독일 | 72.691 | |
| 21G 바늘 | Nipro, 일본 | HN-2138-ET | |
| 23G 바늘 | Nipro, 일본 | HN-2338-ET | |
| 5mL 주사기 | Nipro, 일본 | SY3-5SC-EC | |
| 6mm 원형 유리 커버 슬립 | Menzel Glasser, 독일 | 630-2113 | |
| 60mm 페트리 접시 | ThermoFisher Sientific, 미국 | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, 독일 | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, 독일 | ||
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich, 독일 | B6917 | |
| 염화칼슘 | Sigma-Aldrich, 독일 | 2110 | |
| 원심분리기 | Eppendorf, 독일 | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, 독일 | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, 독일 | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, 독일 | D5648 | |
| 당나귀-안티 염소 AlexaFluor 647 IgG 항체 | Invitrogen, 미국 | A-21447 | |
| 당나귀-안티 마우스 AlexaFluor 488 IgG 항체 | Invitrogen, 미국 | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, 독일 | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, 독일 | E4378 | |
| " evolve"-EM 512 디지털 카메라 시스템 | 광량, 미국 | ||
| 태아 소 혈청(FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, 미국 | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | GNU General Public License | ||
| FITC 필터 세트에 | Chroma Technology Inc., 미국 | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, 미국 | F14201 | |
| 염소 안티 IBA1 | Fujifilm Wako Chemicals, 미국 | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, 프랑스 | P5455 | |
| 고속 솔루션 교환 시스템 | ALA Scientific Instruments, 미국 | ||
| 인큐베이터 | Memmert GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| 마그네슘 | Sigma-Aldrich, 독일 | M2393 | |
| Matlab 소프트웨어 | Math Works, 미국 | ||
| 마우스 anti-GFAP | Merck Millipore, 미국 | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal 당나귀 혈청 | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and 스트렙토마이신 | ThermoFisher Sientific, 미국 | 15140122 | |
| 폴리-L-라이신 | Sigma-Aldrich, 독일 | P5899 | |
| 염화칼 | Sigma-Aldrich, 독일 | P5405 | |
| 인산이수소 | Carlo Erba 시약, 스페인 | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, 미국 | ||
| 중탄산나트륨 | Sigma-Aldrich, 독일 | S3817 | |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich, 독일 | S5886 | |
| 인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트 | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| 피루브산나트륨 | Sigma-Aldrich, 독일 | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, 독일 | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, 독일 | T4799 | |
| Vapro 증기압 삼투압계 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., 미국 | ||
| ViiFluor 이미징 시스템 | Visitron System Gmbh, 독일 | ||
| VisiChrome Polychromator 시스템 | Visitron System Gmbh, 독일 | ||
| VisiView 고성능 설정 | Visitron System Gmbh, 독일 | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, 일본 |
참고문헌
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
