자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.
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방법 논문
조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상
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이 논문에서
요약
초록
자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 조직 진단을 위한 강력한 광학 이미징 기술로 부상하고 있습니다. 최근 몇 년 동안 두 가지 색상 SRS는 헤마톡실린과 에오신(H&E)과 동등한 이미지를 제공하여 뇌암을 빠르고 안정적으로 진단할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 기능은 흥미 진진한 수술 중 암 진단 응용 프로그램을 가능하게했습니다. 조직의 두 가지 컬러 SRS 이미징은 피코초 또는 펨토초 레이저 소스로 수행 할 수 있습니다. 펨토초 레이저는 빠른 하이퍼스펙트럼 이미징과 실시간 이색 SRS 이미징을 포함한 유연한 이미징 모드를 가능하게 하는 장점이 있습니다. 처프 레이저 펄스를 사용한 스펙트럼 포커싱 접근법은 일반적으로 높은 스펙트럼 분해능을 달성하기 위해 펨토초 레이저와 함께 사용됩니다.
두 가지 색상 SRS 수집은 직교 변조 및 잠금 감지를 통해 실현할 수 있습니다. 펄스 처핑, 변조 및 특성화의 복잡성은이 방법의 광범위한 채택을위한 병목 현상입니다. 이 기사는 에피 모드에서 마우스 뇌 조직의 스펙트럼 포커싱 SRS 및 실시간 이색 이미징의 구현 및 최적화를 입증하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 SRS의 고속 및 분광학적 이미징 기능을 활용하는 광범위한 SRS 이미징 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.
서론
전통적인 조직 진단은 염색 프로토콜에 의존하고 광학 현미경으로 검사합니다. 병리학자가 사용하는 일반적인 염색 방법 중 하나는 H & E 염색입니다 : 헤마톡실린은 세포 핵을 자줏빛 파란색으로 염색하고 에오신 염색은 세포외 매트릭스와 세포질 분홍색을 염색합니다. 이 간단한 염색은 많은 조직 진단 작업, 특히 암 진단을위한 병리학의 황금 표준으로 남아 있습니다. 그러나 H&E 조직병리학, 특히 수술내 환경에서 사용되는 냉동 절편술은 여전히 한계가 있다. 염색 절차는 조직 매립, 절개, 고정 및 염색1과 관련된 힘든 과정입니다. 일반적인 처리 시간은 20분 이상입니다. 동결 단면화 중에 H&E를 수행하는 것은 마진 평가를 위해 3D에서 세포 특징이나 성장 패턴을 평가해야 하기 때문에 여러 섹션을 한 번에 처리할 때 더욱 어려워질 수 있습니다. 또한, 수술 내 조직학 기술은 숙련 된 기술자와 임상의가 필요합니다. 많은 병원에서 보드 인증 병리학자 수의 제한은 많은 경우에 수술 내 상담의 제약입니다. 이러한 한계는 디지털 병리학 및 인공 지능 기반 진단에 대한 빠른 개발 관심으로 완화 될 수 있습니다2. 그러나 H&E 염색 결과는 기술자의 경험에 따라 가변적이어서 컴퓨터 기반 진단2<....
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프로토콜
모든 실험 동물 절차는 워싱턴 대학의 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜 (# 4395-01)에 따라 200 μm, 고정, 절편화 된 마우스 두뇌로 수행되었다. 야생형 마우스(C57BL/6J 균주)를CO2로 안락사시킨다. 그런 다음 인산염 완충 식염수의 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하기 위해 뇌를 추출하기 위해 두개골 절제술을 실시합니다. 뇌는 3% 아가로스와 0.3% 젤라틴 혼합물에 매립되어 비브라톰에 의해 200μm 두께의 조각으로 절편화된다.
1. 초기 정렬
주: 최상의 감도와 해상도를 위해 두 팔의 빔 크기와 발산이 일치하는지 확인하십시오. 펌프와 Stokes 빔을 대조하고 레이저 스캐닝 현미경에 들어가기 전에 크기를 조정하십시오. 이렇게하려면 이색성 거울에 결합하기 전에 각 빔에 한 쌍의 무색 렌즈를 사용하십시오. 빔 정렬을 위해 항상 적절한 레이저 고글을 착용하십시오.
- 빔 시준
- 펌프 빔을위한 무채색 렌즈 한 쌍을 설치하십시오. 시작점으로 100mm 렌즈와 200mm 렌즈를 사용하여 레이저 빔 크기를 2배 확대합니다. 두 렌즈의 거리가 대략 300mm인지 확인하십시오. ....
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결과
스펙트럼 분해능 최적화:
물질을 통한 분산은 분산 매질(길이 및 물질) 및 파장에 의해 영향을 받는다. 분산봉 길이를 변경하면 스펙트럼 분해능과 신호 크기에 영향을 미칩니다. 그것은 응용 프로그램에 따라 다르게 무게가 가질 수있는 주고받는 관계입니다. 막대는 빔 펄스를 주파수가 넓고 시간이 좁아지는 것에서 주파수가 좁고 시간이 넓어지는 것까지 뻗어 나갑니다. 그림 7은 다양한 막대 길이가 스펙트럼 분해능에 미치는 영향을 보여줍니다. 도 7A는 매우 불량한 스펙트럼 분해능을 보여준다; 이 설정에는 유리 짹짹 거리는 막대가 없으며 DMSO의 두 라만 피크는 전혀 해결되지 않습니다. 그림 7B,C에서, 유리 짹짹 막대의 수의 증가는 두 피크를 해결하기 시작한다. 마지막으로,
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토론
이 프로토콜에 제시된 두 가지 색상 SRS 이미징 체계는 단색 SRS 이미징의 적절한 구현에 달려 있습니다. 단색 SRS 이미징에서 중요한 단계는 공간 정렬, 시간 정렬, 변조 깊이 및 위상 이동입니다. 두 빔을 공간적으로 결합하는 것은 이색성 거울에 의해 달성된다. 여러 스티어링 미러는 빔을 이색성 거울로 보낼 때 미세 조정에 사용됩니다. 빔이 이색성 미러와 결합되면 결합 된 빔이 IR 카드와 겹치는지 확인하는 동안 >1m 떨어진 벽쪽으로 보내기 위해 거울과 결합 된 빔 경로를 선택하여 공간 정렬을 확인할 수 있습니다. 현미경을 통한 공간 정렬에 따라, 시간적 중첩은 역반사기 기반 지연 단계로 경로 길이를 조정함으로써 수행되며, 이는 공간 정렬을 보존하는 이점이 있다. 1,040nm 암은 이 프로토콜에서 지연된 빔입니다. 지연 스테이지가 두 빔이 일시적으로 겹치도록 하는 범위를 갖지 않는 경우 시간적 중첩은 불가능합니다. 이 경우, 시간적 중첩이 지연 스캔 범위의 중간에가까운지 확인하기 위해 전체 지연 스테이지를 다른 위치로 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
본 연구는 NIH R35 GM133435 내지 D.F.에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 무채색 렌즈 | THORLABS | AC254-100-B | 광대역, 650 - 1,050 nm, 무채색 렌즈 초점 거리, 100 mm |
| 20 MHz 대역통과 필터 | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC 대역 통과 필터, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm 무채색 렌즈 | THORLABS | AC254-200-B | 광대역, 650 - 1,050 nm, 무채색 렌즈 초점 거리, 200 mm |
| 무채색 반파장판 | 유니온 광학 | WPA2210-650-1100-M25.4 | 광대역 반파장판 |
| 무채색 쿼터 웨이브 플레이트 | 유니온 광학 | WPA4210-650-1100-M25.4 | 광대역 쿼터 웨이브 플레이트 |
| 빔 샘플러 | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | 중심 파장이 약 1,000nm인 다른 이색성을 사용할 수 있습니다. |
| DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | 라만 이동 교정용 용매. 알려진 라만 피크를 가진 다른 용매를 사용할 수 있습니다. |
| 전기 광학 진폭 변조기 | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | 직교 변조 및 이중 채널 이미징에는 두 개의 EOM이 필요합니다. 더 낮은 구동 전압을 사용할 수 있도록 공진 버전을 사용하는 것이 좋습니다. |
| 거짓 H& E 염색 스크립트 | Matlab | ||
| https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining 팬아웃 버퍼 | PRL-414B | 펄스 연구소 | 1:4 TTL/CMOS 팬아웃 버퍼 및 라인 드라이버, EOM 구동 주파수 및 잠금 |
| 포토다이오드 | THORLABS | DET10A2 | 1ns 상승 시간 |
| 주파수 분배기 | PRL-220A | 펄스 연구소 | TTL 주파수 분배기(f/2, f/4, f/8, f/16), 레이저 출력에서 20MHz 생성용. |
| 고분산 유리 막대 | 유니온 광학 | CYLROD01 | 고분산 H-ZF52A 막대 렌즈 120 mm, SF11 막대 렌즈 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | 레이저 시스템은 두 개의 동기화 펄스 레이저(1, 040 nm에서 하나의 고정 빔과 680-1,300 nm 범위의 조정 가능한 빔)를 80 MHz의 반복률로 출력할 수 있습니다. | |
| 락인앰플리파이어 | 리퀴드 인스트루먼트 | Moku Lab | 락인앰플리파이어는 포토다이오드에서 SRS 신호를 추출합니다. 취리히 인스트루먼트 HF2LI 또는 이와 유사한 기기도 사용할 수 있습니다. |
| 미러 | THORLABS | BB05-E03-10 | 광대역 유전체 미러, 750 - 1,100 nm. 은색 거울도 사용할 수 있습니다. |
| 전동 지연 스테이지 | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | 펌프와 스톡스 레이저의 시간적 겹침을 미세 제어하기 위한 지연 스테이지. 다른 전동 스테이지가 작동해야 합니다. |
| 오일 침지 응축기 | 니콘 | CSC1003 | 1.4 NA. NA>1.2가 있는 다른 콘덴서를 사용할 수 있습니다. |
| 오실로스코프 | Tektronix | TDS7054 | 400MHz 대역 이상의 다른 오실로스코프가 작동해야 합니다. |
| 위상 시프터 | SigaTek | SF50A2 | 변조 주파수의 위상 이동용 |
| 포토다이오드 | Hamamatsu Corp | S3994-01 | 넓은 면적(10 x 10cm2)의 실리콘 PIN 다이오드. 면적이 넓고 정전 용량이 낮은 다른 다이오드를 사용할 수 있습니다. |
| 편광 빔 스플리터 | 유니온 옵틱 | PBS9025-620-1000 | 광대역 편광 빔 스플리터 |
| 굴절률 데이터베이스 | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR 직각 프리즘. 다른 프리즘 또는 역반사체를 사용할 수 있습니다. |
| RF 전력 증폭기 | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω |
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| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0mm 프리미엄 Shortpass Filter, 차단 파장: 1,000nm. 스톡스를 효율적으로 억제하기 위해서는 두 개의 필터가 필요할 수 있습니다. |
| 정립 현미경 | Nikon | Eclipse FN1 | 다른 현미경 프레임을 사용할 수 있습니다. 레이저 스캐닝 현미경을 사용할 수 있는 경우 직접 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 갈보 스캐너와 스캔 렌즈를 현미경에 추가해야 했습니다. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | 다광자 25X 대물렌즈의 개구수는 1.05입니다. 다른 유사한 목표를 사용할 수 있습니다. |
참고문헌
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. ....
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재인쇄 및 허가
