미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

Summary

이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.

Abstract

뇌는 더 이상 고립되어 기능하는 기관으로 간주되지 않습니다. 축적 된 증거는 말초 면역 체계의 변화가 간접적으로 뇌 기능을 형성 할 수 있음을 시사합니다. 뇌와 전신 순환 사이의 계면에서, 혈액 뇌척수액 장벽을 구성하는 맥락막 신경총(CP)은 주변부와 뇌 간 통신의 핵심 부위로 강조되고 있다. CP는 뇌척수액, 신경 영양 인자 및 뇌 항상성을 형성 할 수있는 신호 전달 분자를 생산합니다. CP는 또한 활성 면역 학적 틈새 시장입니다. 생리적 조건 하에서 주로 미세아교세포에 의해 채워지는 뇌 실질과는 달리, CP 면역 세포의 이질성은 다른 말초 기관에서 발견되는 다양성을 되풀이한다. CP 면역 세포 다양성 및 활성은 노화, 스트레스 및 질병에 따라 변화하고 CP 상피의 활성을 조절하여 간접적으로 뇌 기능을 형성합니다. 이 프로토콜의 목표는 뮤린 CP를 분리하고 그들을 채우는 주요 면역 서브 세트의 약 90 %를 확인하는 것입니다. 이 방법은 CP 면역 세포를 특성화하고 주변부와 뇌 간 의사 소통을 조율하는 기능을 이해하는 도구입니다. 제안 된 프로토콜은 CP 면역 세포가 건강 및 다양한 질병 조건에서 간접적으로 뇌 기능을 조절하는 방법을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

19 ^세기 후반 Paul Erhlich가 혈액 - 뇌 장벽을 발견 한 이래로 뇌는 다른 장기 및 혈류와 사실상 분리 된 것으로 간주되어 왔습니다. 그러나 지난 10 년 동안 뇌 기능은 장내 미생물 및 전신 면역 세포 및 신호와 같은 다양한 생물학적 요인에 의해 형성된다는 개념^의 출현을 보았습니다^1,2,3,4. 동시에, 수막과 맥락막 신경총(CP)과 같은 다른 뇌 경계는 불활성 장벽 조직보다는 활성 면역-뇌 교차 대화의 계면으로 확인되었다5,6,7,8.

CP는 뇌와 주변을 분리하는 경계 중 하나 인 혈액 뇌척수액 장벽을 구성합니다. 그들은 뇌의 네 개의 심실, 즉 세 번째, 네 번째 및 양쪽 측심실 각각에 위치하고 있으며 해마의 심실 하부 영역 및 세분화 된 영역과 같은 ....

Protocol

모든 절차는 실험실 동물 취급에 대한 유럽 집행위원회의 지침, 지침 86/609/EEC에 동의했습니다. 그들은 윤리위원회 번호 59, CETEA/CEEA No. 089, dap210067 및 APAFIS #32382-2021070917055505 v1의 승인을 받았습니다.

1. 물질의 제조

1. 모든 항체 (물질 표)를 4°C에서 저장하고, 광 노출로부터 보호한다.
2. DAPI 원액 (1 mg/mL): 분말을 PBS-/- (표 물질), 분취액에 재현탁시키고, ^-20°C에서 저장한다.
3. DAPI 작업 용액 (0.1 mg/mL): DAPI 원액을 PBS^-/- 1:10의 비율로 희석합니다.
4. 자기-활성화 세포 분류(MACS) 완충액: PBS-^/-에서 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(표 자료)을 준비한다.
5. 콜라게나제 IV 원액 (20 U/μL): 분말을 PBS^+/+ (표 물질), 분취액에 재현탁시키고....

Results

여기에 제시된 유세포 분석 결과 골수성 및 T 세포의 주요 하위 집합 (각각 그림 1 및 그림 2)과 고도로 재현 가능한 방식으로 마우스 당 상대적 총 수가 성공적으로 밝혀졌습니다 (그림 3).

골수성 세포의 유세포 분석 결과, CP는 CD11b+ _CX3CR1⁺ F4/^80high BAM에 의해 채워져 CP에서 CD45⁺ 면역 세포의 거의 80%를 차지하는 것으로 나타났다. 이들 BAM은 MHC-II의 발현에 따라 두 개의 상이한 집단으로 나뉘어졌다: 이전에 발표^{된 데이터7}에 따라 주요 그룹(CD45+ 면역 세포의 72%)을 구성한 IA-IE^{+ BAM}

Discussion

뇌 항상성 및 질병에 대한 면역학적 기여를 이해하려는 연구는 주로 뇌 실질 내에 존재하는 세포에 초점을 맞추었고, 그럼에도 불구하고 뇌 기능에 중요한 기여자인 CP와 같은 뇌 경계를 무시했다^2,3. CP에서 면역 세포 집단의 분석은 CP의 크기가 작고, 상주 면역 세포의 수가 적으며,이 조직에 대한 복잡한 접근으로 인해 어렵습니다. 총 뇌 면역 세포 (CD45⁺)에 대해 수행 된 유세포 측정은 CP에 상주하는 희귀 한 면역 집단의 특성화를 허용하지 않습니다. CP의 면역 조성을 높은 정밀도로 특성화하기 위해, PBS 관류 마우스로부터 해부된 CP에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 이러한 접근법은 순환하는 CD45⁺ 세포 및 CP ^CD45-세포, 예컨대 혈관주위세포, 내피 및 상피 세포의 배제를 허용한다³². 골수성 및 T 세.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
안티 마우스 CD16/CD32	BD Biosciences,	553142	유세포 분석 항체
, 알부민, 소	MP, Biomedicals	160069	차단 시약
APC, 안티 마우스 CX3CR1	BioLegend	149008	유세포 분석 항체
APC 안티 마우스 TCRb	BioLegend	109212	유세포 분석 항체
APC-Cy7, 안티 마우스 CD4	BioLegend	100414	유세포 분석 항체
APC-Cy7 안티 마우스 IA-IE	BioLegend	107628	유세포 분석 항체
BD FACSymphony A5 세포 분석기	BD Biosciences		유세포 분석 분석기
BV711 안티 마우스 Ly6C	BioLegend	128037	유세포 분석 항체
Collagenase IV	Gibco	17104-019	Enzyme to Dissociate CP Tissue
DAPI	Thermo Scientific	62248	Live/dead marker
EDTA			이온 킬레이터
미세 가위	FST	14058-11	Dissection tool
FITC anti-mouse CD45	BioLegend	103108	유세포 분석 항체
Flow controller 주입 삽입	CareFusion	RG-3-C	혈액 관류
삽입 FlowJo 소프트웨어	BD Biosciences		분석 소프트웨어
겸자	FST	11018-12	해부 도구
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	항응고제
Imalgene	Boehringer Ingelheim		Ketamine, 마취제
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	실현 제어 비드 compensation
PBS-/-	Gibco	14190-094	Buffer
PBS+/+	Gibco	14040-091	Buffer
PE anti-mouse CD8a	BioLegend	100708	유세포분석 항체
PE anti-mouse F4/80	BioLegend	123110	유세포분석 항체
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b	BioLegend	101256	유세포분석 항체
Rompun	바이엘		자일라진, 마취
얇은 집게	Dumoxel 생물학	11242-40	해부 도구
Vetergesic	Ceva		Buprenorphin, 진통제