이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
제브라피쉬는 놀라운 평생 성장과 재생 능력을 발휘합니다. 예를 들어, 배아 발생 중에 확립 된 특수 줄기 세포 틈새 시장은 눈과 뇌 모두에서 전체 시각 시스템의 지속적인 성장을 지원합니다. 망막과 광학 텍텀 사이의 조정 된 성장은 눈과 뇌에 새로운 뉴런이 추가됨에 따라 정확한 망막 토픽 매핑을 보장합니다. 망막 축삭이 생존, 증식 및/또는 분화와 같은 지각 줄기 및 전구 세포 행동을 조절하는 데 중요한 정보를 제공하는지 여부를 해결하기 위해서는 동일한 동물 내의 신경질과 탈핵된 지체 엽을 비교할 수 있어야 합니다.
살아있는 애벌레 제브라 피쉬에서 한쪽 눈을 외과 적으로 제거한 다음 광학 텍텀을 관찰하면이 목표를 달성합니다. 첨부 된 비디오는 애벌레를 마취하고, 전해로 텅스텐 바늘을 날카롭게하고, 한쪽 눈을 제거하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 다음으로 고정 된 제브라 피쉬 애벌레에서 뇌를 해부하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 비디오는 면역 조직 화학을위한 프로토콜에 대한 개요와 현미경 검사를 위해 저융점 아가로스에 염색 된 배아를 장착하는 방법에 대한 데모를 제공합니다.
서론
이 방법의 목표는 망막 입력이 제브라 피쉬 뇌의 시각 처리 센터 인 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 것입니다. 한쪽 눈을 제거한 다음 광학 텍텀의 양면을 비교함으로써 동일한 시편 내의 텍탈 변화를 관찰하고 표준화하여 여러 표본에서 비교할 수 있습니다. 이 기술과 결합 된 현대 분자 접근법은 시각적 시스템 성장 및 개발뿐만 아니라 축삭 변성 및 재생의 기초가되는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 것입니다.
시각, 청각 및 신체 감각 - 감각 시스템은 외부 기관으로부터 정보를 수집하고 그 정보를 중추 신경계로 전달하여 중뇌 1,2에 걸쳐 외부 세계의 "지도"를 생성합니다. 시력은 많은 물고기를 포함한 거의 모든 척추 동물에게 지배적 인 감각 양식입니다. 눈의 신경 조직인 망막은 주로 광수용체, 양극성 세포, 망막의 돌출부 뉴런인 망막 신경절 세포(RGCs)로 구성된 뉴런 회로로 정보를 수집합니다. RGC는 망막의 내부 표면을 가로 질러 시신경 머리로가는 길을 찾는 긴 축삭을 가지고 있으며, 뇌를 통해 매혹되고 함께 여행하며 궁극적으로 등쪽 중뇌의 시각 처리 센터에서 끝납니다. 이 구조는 물고기 및 다른 비 포유류 척추 ....
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프로토콜
이 논문의 방법은 Reed College 및 University College London의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 승인에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 제브라피쉬 균주에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 재료 및 도구 준비
- 솔루션을 만드세요.
- 60x 스톡(300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl2-이수화물, 및 20 mMMgCl2-육수화물)을 탈이온수에 희석하여 배아배지(E314)를 만들고, 오토클레이브하고, 실온에서 저장하였다. 160 mL의 60x E3를 10 L의 탈이온수에 첨가한다. 실온에서 보관하십시오.
- E3에서 1 % 낮은 융점 (LMP) 아가로스를 만드십시오. LMP 아가로스 1 g을 E3 100 mL에 녹여 전자레인지에서 1-2분 동안 고출력으로 끓인다. 분취량 용융 아가로오스를 1.7 mL 마이크로퍼지 튜브 내로 첨가하고, 4°C에서 저장한다. 수조에서 끓여서 매립에 사용할 준비가 되었을 때 40°C의 열 블록을 유지하십시오.
- 10x 스톡을 희석하....
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결과
눈 제거가 완료되었는지 여부를 확인하고 시신경 텍텀이 어떻게 변하는지를 평가하기 위해, 모든 RGC를 막 표적 RFP로 라벨링하는 Tg[atoh7:RFP] 균주에서 수술을 수행했으며, 따라서 망막으로부터 투사되어 시신경을 형성하는 모든 축삭기(24)를 형성한다. 이 균주를 사용하는 것이 절대적으로 필요한 것은 아니지만, 시신경 텍텀 뉴로필에서 시신경 테르미니를 직접 관찰하고 시각화 할 수 있습니다. 친유성 DiI 또는 DiO 염료25,26을 사용한 축삭 추적 또는 brainbow 27을 사용한 다중 스펙트럼 표지와 같은 시신경을 표지하기 위한 다른 접근법도 또한 가능할 것이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 시신경텍텀 뉴로필.......
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토론
이 논문에 설명 된 기술은 제브라 피쉬에서 척추 동물 시각 시스템 개발을 연구하기위한 많은 접근법 중 하나를 보여줍니다. 다른 연구자들은 배아 망막을 해부하고 유전자 발현 분석19 를 수행하거나 광학 텍텀30에서 신경 활동을 시각화하는 방법을 발표했습니다. 이 논문은 차등 망막 입력이 광학 텍텀의 세포 행동에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 탐구하기위한 접근법을 제공합니다.
수술 후 성공적인 눈 소멸과 애벌레 생존을 보장하기 위해서는 유충이 건강하고 적절하게 마취되며 1 % 아가로스에 고정되어있는 것이 중요합니다. 포셉과 텅스텐 바늘이 매우 날카 롭고 깨끗한 것도 중요합니다. 유충은 수술 전후에 24 시간을 먹이지 않을 때 가장 잘 생존하며, 항생제가 보충 된 MMR에서 유충을 기르면 치유 과정이 빨라집니다. 중요하게도, MMR의 더 높은 이온 강도 및 특히 칼슘의 더 높은 농도는 치유를 촉진한다.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업에 대한 기금은 주로 Reed College에서 KLC에 이르는 창업 기금, Helen Stafford Research Fellowship 기금에서 OLH로, Reed College Science Research Fellowship에서 YK에 지원되었습니다. 이 프로젝트는 Steve Wilson의 실험실에서 Wellcome Trust Studentship (2009-2014)의 지원을 받은 HR과의 협력으로 시작되었습니다. 이 프로젝트에 대한 초기 토론을 위해 Máté Varga, Steve Wilson 및 Wilson 연구소의 다른 구성원들에게 감사 드리며, 특히 KLC에 아가로스에 배아를 장착하고 제브라 피쉬 뇌 해부를 수행하는 방법을 처음으로 가르친 Florencia Cavodeassi와 Kate Edwards에게 감사드립니다. 우리는 또한 Greta Glover와 Jay Ewing에게 텅스텐 바늘 연마 장치를 조립하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 장비 및 용품: | |||
| Breeding boxes | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning 고진공 그리스 | Sigma 또는 이와 동등한 공급업체 | Z273554 | |
| Erlenmeyer 플라스크(125mL) | 수술 후 배양을 위한 항생제가 함유된 Marc's Modified Ringers(MMR) 제조용. | ||
| 파인 펜치 - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| 유리 파스퇴르 피펫 | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | 배아 및 유충 피펫팅용. |
| 현미경 검사용 유리 슬라이드 | VWR 또는 동급 공급업체 | : 48311-703 | 표준 유리 현미경 슬라이드는 다양한 실험실 공급업체에서 주문할 수 있습니다. |
| 눈금이 매겨진 병과 눈금이 매겨진 실린더 | 용액을 만들고 보관하기 위해. | ||
| 2액형 에폭시 수지 | ACE 하드웨어 또는 Gorilla Glue 또는 이에 상응하는 기타 공급업체 | 0.85oz 주사기 | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| 마이크로 원심분리기 튜브(1.7mL), | VWR 또는 동급의 공급업체 | 22234-046 | |
| 니켈 도금 핀 홀더(길이 17cm) | Fine Science Tools(FST) | 26018-17 | 수술 / 해부를 연마하고 수행하는 동안 텅스텐 와이어를 고정합니다. |
| 나일론 메쉬 차 여과기 또는 이에 상 | 응하는 Ali Express 또는 동급 | 산란 후 제브라 피쉬 알을 수확하기 위해;https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| 종이 클립 | 텅스텐 바늘 숫돌 장치용. | ||
| 페트리 접시 100mm | Fischer Scientific 또는 동급 공급업체 | 50-190-0267 | |
| 페트리 접시 35mm | Fischer Scientific 또는 동급 공급업체 | 08-757-100A | |
| 피펫 펌프 | SP Bel-Art 또는 동급 | F37898-0000 | |
| 수산화칼륨(KOH) | 시그마 | 909122 | 텅스텐 바늘 날카롭게하는 장치. 탈이온수에 펠릿을 추가해서 두건에 있는 KOH의 10% w/v 해결책을 만드십시오. |
| 전원 공급 장치 (가변 전압) | 텅스텐 바늘 샤프닝 장치 용. 가변 전압의 모든 전원 공급 장치가 작동합니다(겔 전기영동에 사용되는 전원 공급 장치도 해당). | ||
| Sylgard 184 엘라스토머 키트 | 다우 코닝 | 3097358 | |
| 텅스텐 와이어 (직경 0.125mm) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | 눈을 제거하고 유충을 해부하기 위해 날카롭 |
| 가변 온도 열 블록 | Lab Depot 또는 이에 상응하는 공급업체 | BSH1001 또는 BSH1002 | 40-42°로 설정합니다. C는 실험보다 앞서 있습니다. |
| 뚜껑이 있는 입이 넓은 유리 항아리(예: 깨끗한 잼 또는 살사 항아리) | 텅스텐 바늘 숫돌 장치용. | ||
| 앨리게이터 클립 리드 | 텅스텐 바늘 샤프닝 장치용. | ||
| microscopes: | |||
| Dissecting microscope | 모든 유형이 작동하지만 미러 베이스에 조정 가능한 투과광이 있는 것이 선호됩니다. | ||
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | 높은 개구수, 20-25x 수침 대물 렌즈를 권장합니다. 현미경 제어 및 이미지 캡처 소프트웨어(Nikon의 NIS-Elements)가 사용되지만 모든 컨포칼 현미경이 작동합니다. | ||
| 수술 및 해부용 시약: | |||
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | Marc's Modified Ringers(MMR) 및 배아 배지(E3)용. |
| HEPES | Sigma | H7006 | Marc의 개조 된 벨소리 (MMR). |
| 저융점 아가로스 | Invitrogen | 16520-050 | 배아 배지(E3) 또는 Marc's Modified Ringers(MMR)에서 1%를 만듭니다. |
| 염화마그네슘 육수화물 | 시그마 | 1374248 | 배아 배지(E3)용. |
| 황산 마그네슘 | Sigma | M7506 | Marc의 수정 링거 (MMR) 용. |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 Sciences | 19210 | 8%(w/v) 스톡을 2x 농축 PBS(10x PBS 스톡에서 희석)로 희석합니다. |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마 | P4333-20ML | Marc의 변형 링거에서 1:100을 희석합니다. |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 정제 | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | 탈이온수에 10배 재고를 만들고 오토클레이브하여 실온에서 보관하십시오. 작업 농도의 1배로 희석합니다. |
| 염화칼륨 | Sigma | P3911 | Marc's Modified Ringers(MMR) 및 배아 배지(E3)용. |
| 염화나트륨 | Sigma | S9888 | Marc's Modified Ringers(MMR) 및 배아 배지(E3)용. |
| 수산화나트륨 | 시그마 | S5881 | 10m를 만들고 MMR의 pH를 7.4로 조정하는 데 사용합니다. |
| 설탕 | 시그마 | S9378 | |
| 트리카인- | S 펜테어 | 100G | #TRS1 레시피: |
| https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE면역조직화학용 시약: | |||
| Alexafluor 568 태그가 지정된 토끼 IgG | Invitrogen | A-11011 | wholemount를 위해 1:500 희석에서 사용 면역조직화학. |
| DAPI 또는 ToPro3 | Invitrogen | 1306 또는 T3605 | DMSO에서 1 mg/mL 용액을 구성합니다. 대조염색을 위한 1:5,000 희석. |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | 시그마 | D8418 | 면역블록 완충액의 구성 요소. |
| 메탄올 (MeOH) | Sigma | 34860 | MeOH를 PBST와 같은 수용액과 혼합하는 것은 발열입니다. MeOH/PBST 용액은 최소 몇 시간 전에 만들거나 사용하기 전에 얼음으로 식히십시오. |
| 일반 염소 혈청 | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | 면역차단 완충액의 성분. 1-10 mL 용량으로 분주할 수 있으며 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. |
| Millipore | 06-570 | 을 검출하기 위한 1차 항체 | wholemount immunohistochemistry를 위해 1:300 희석에서 사용합니다. |
| 적색 형광 단백질을 검출하기 위한 기본 항체(RFP, dsRed 유도체 검출) | MBL International | PM005 | wholemount immunohistochemistry를 위해 1:500 희석에서 사용합니다. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | PBS에서 10 mg/mL 원액을 구성하고 10 &마이크로에서 사용합니다. g/mL입니다. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | PBS에서 20%(v/v) 스톡 솔루션을 만드는 데 유용합니다. |
| 데이터 분석용 소프트웨어 | |||
| ImageJ (피지) | 이미지 분석용 프리웨어; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| RStudio | 통계 분석 및 데이터 시각화용 프리웨어; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop 또는 GIMP | 독점적인 이미지 처리 소프트웨어(Adobe Photoshop 및 Illustrator)는 종종 그림을 구성하는 데 사용됩니다. 프리웨어 대안은 Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains. 이 연구는 AB, TU, Tg[atoh7:RFP] 균주를 사용했습니다. | 다음에서 사용 가능 미국(https://zebrafish.org/home/guide.php) 또는 유럽(https://www.ezrc.kit.edu/)에 있는 제브라피시 국제 리소스 센터. 아직 리소스 센터에 기탁되지 않은 특수 형질전환 균주는 발표 후 개별 실험실에 요청할 수 있습니다. |
참고문헌
- Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
- Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36
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