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방법 논문

리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 불활성화

2.1K 조회수

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DOI:

10.3791/63531

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2022년 4월 6일

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1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

이 논문에서

요약

여기에서는 낮은 강도의 청색 및 보라색 광 조사 하에서 플라 빈 모노 뉴클레오티드 (FMN)의 광분해 중에 생성 된 활성 산소 종으로 병원성 박테리아를 비활성화하는 프로토콜을 제시합니다. FMN 광분해는 위생 공정을위한 간단하고 안전한 방법으로 입증되었습니다.

초록

리보플라빈-5'-포스페이트(또는 플라빈 모노뉴클레오티드; FMN)은 가시광선에 민감하다. 활성 산소 종 (ROS)을 포함한 다양한 화합물은 가시 광선 조사시 FMN 광분해로부터 생성 될 수있다. FMN 광분해에서 생성 된 ROS는 황색 포도상 구균 (S. aureus)과 같은 병원성 박테리아를 포함한 미생물에 유해합니다. 이 기사에서는 가시 광선 조사 하에서 FMN과 관련된 광화학 반응을 통해 S. aureus를 비활성화하는 프로토콜을 제시합니다. FMN 광분해 동안 생성 된 슈퍼 옥사이드 라디칼 음이온 ()은 니트로 블루 테트라 졸륨 (figure-abstract-1NBT) 환원을 통해 평가됩니다. 반응성 figure-abstract-2 종에 기인하는 S. aureus의 미생물 생존력은 공정의 효과를 결정하는 데 사용되었습니다. 박테리아 불활성화 비율은 FMN 농도에 비례합니다. 보라색 빛은 청색광 조사보다 S. 아우레우스를 비활성화하는 데 더 효율적입니다., 적색 또는 녹색 빛은 FMN 광분해를 유도하지 않습니다. 본 기사는 위생 공정을위한 간단하고 안전한 방법으로 FMN 광분해를 보여줍니다.

서론

리보플라빈 -5'- 인산염 (FMN)은 리비틸 측쇄의 리보플라빈 5'- 위치에서 인산화에 의해 형성되며 에너지를 생성하는 수많은 세포 과정을 위해 모든 플라 보 단백질에 필요합니다. 또한 인체의 일부 기능을위한 비타민의 역할을합니다1. FMN은 리보플라빈2보다 물에 약 200 배 더 잘 녹습니다.

박테리아의 항균 광역학 불활성화(aPDI)는 박테리아 내성 모드에 의존하지 않기 때문에 박테리아 3,4에 대한 내성을 제어하는 효율적인 방법입니다. 임상 적으로 aPDI는 다중 내성 박테리아 5,6,7,8,9로 인한 병원 내 피부 감염을 줄이기 위해 연조직 감염을 치료하는 데 사용됩니다. aPDI는 또한 활성 산소 종 (ROS)을 생성하여 세포 사멸을 생성합니다. 수퍼옥사이드 라디칼 (), 일중항 산소, 하이드록실 라디칼 (•OH) 및 퍼옥실 라디칼과 같은 ROS는 활성 산소(10,11,12)를 포함하고 정상적으로 반응성(figure-introduction-113)인 자유 라디칼 또는 분자이다. ROS에 의해 유발되는 DNA 손상과 유사하게, 막 과산화 및 내피 세포의 파괴는 또한 세포(12)에서 ROS에 기인하는 불리한 생화학적 반응이다.

병원성 박테리아에 대한 aPDI의 사용은 메틸티오니늄클로라이드 14, PEI-c e6 접합체 15, 포르피린16, 이산화 티탄 17, 톨루이딘 블루O18 및 산화 아연 나노 입자 19와 같은 화합물의 존재 하에서 미생물을 불활성화시키는 가시 광선 또는 UV 광원을 포함한다. 톨루이딘 블루 O와 메틸렌 블루는 페 노티 아진 늄 염료이며 메틸렌 블루는 독성이 있습니다. 산화 아연 나노 입자와 UV 조사는 건강 및 환경 적 악영향과 관련이 있습니다. 따라서 가시적 인 조사 하에서 광분해를 통해 신뢰할 수 있고 안전하며 간단한 감광제를 사용하는 것은 추가 연구가 필요합니다.

미량 영양소 인 리보플라빈 또는 FMN은 독성이 없으며 실제로 식품 제조 또는 사료 공급에 사용됩니다20. FMN과 리보플라빈은 모두 빛 조사에 매우 민감합니다2. UV 1,2,21,22,23 및 청색광 조사10,24 하에서이 두 화합물은 여기 상태를 달성합니다. 광분해에 의해 생성 된 활성화 된 리보플라빈 또는 FMN은 삼중 항 상태로 승격되고 ROS는 동시에생성됩니다 2,25. Kumar 등은 자외선에 의해 활성화 된 리보플라빈이 병원성 미생물26에서 DNA의 구아닌 부분에 선택적으로 손상을 일으킨다고보고했다. 자외선에 의한 조사 하에서, 광역학적으로 활성화 된 리보플라빈은 이중 가닥 DNA27에서 산화 스트레스에 대한 바이오 마커 인 8-OH-dG의 생성을 촉진하는 것으로 입증된다. S. 아우 레 우스와 대장균은 리보플라빈 또는 FMN 광분해 동안 ROS에 의해 비활성화되는 것으로보고되었습니다 10,24,28. 저자의 이전 연구에 따르면 리보플라빈과 FMN을 포함하는 광분해 반응은 크리스탈 바이올렛, 트리 아릴 메탄 염료 및 생성하는 항균제 를 감소figure-introduction-2시키고 크리스탈 바이올렛28의 항균 능력의 대부분을 제거합니다. 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 또는 FMN이 청색광에 의해 조사될 때, 생성된 ROS는 시험관내29에서 그들의 중독을 위해 HeLa 세포에서 세포자멸사를 생성한다. 리보플라빈의 존재하에 광화학 처리를 사용하여, Cui 등은 이들의 증식 및 사이토카인 생성을 억제함으로써 림프구를 불활성화시켰다30.

리보플라빈의 광분해는 UV 10,24에 의한 혈액 병원체의 불활성화에 사용되지만, 자외선 조사(30) 하에서 혈액 성분이 손상 될 수있다. 또한 UV에 노출 된 혈소판은 세포막에서 활성화 마커 P- 셀렉틴 및 LIMP-CD63의 성능을 점진적으로 향상시키는 것으로보고되었습니다. UV 및 고강도 조사의 세포 독성을 조사해야하며 가시 광선을 포함하는 FMN 광반응 중에 복잡하지 않고 안전한 감광제가 유용 할 것입니다.

더 짧은 파장의 빛은 더 많은 에너지를 가지며 세포에 심각한 손상을 줄 가능성이 훨씬 더 큽니다. 그러나, 적합한 감광제의 존재 하에서, 저 강도 보라색 빛으로 조사하면 병원성 미생물을 억제 할 수있다. 따라서 보라색 빛을 조사할 때 FMN에 figure-introduction-3 의한 감광성 및 생성은 FMN으로부터 ROS가 박테리아의 불활성화를 증가시키는 경로를 결정하기 위해 연구하는 것이 중요합니다.

항균 제어는 일반적인 문제이며 새로운 항생제의 개발에는 수십 년이 걸리는 경우가 많습니다. 보라색 빛을 조사한 후 FMN에 의해 매개되는 광불활성화는 환경 병원성 박테리아를 전멸시킬 수 있습니다. 이 연구는 FMN 광분해를 유도하여 aPDI를 생성하기 figure-introduction-4 위해 보라색 빛을 사용하는 효과적인 시험관 내 항균 프로토콜을 제시합니다. S. aureus의 미생물 생존력은 FMN 유도 aPDI의 타당성을 결정하는 데 사용됩니다.

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프로토콜

1. 광분해 시스템 설정

  1. 도 1에 도시된 바와 같이 불투명한 플라스틱 컵(8cm x 7cm)의 내부에 6개의 발광다이오드(LED)(DC 12V)를 장착하여 광분해 시스템(31)을 구축한다.
  2. 유리 시험관(직경 13mm, 높이 100mm)에 반응물(아래 참조)을 넣고 그림 1과 같이 컵 상단에 튜브를 고정합니다. 실험 설정을 25 ± 3 °C의 일정한 온도의 방에 두십시오.
  3. 적외선 온도계로 광분해 반응 전반에 걸쳐 테스트 장치의 온도를 모니터링하고 기록합니다.
    참고: 그림 2 는 보정된 UV-Vis 광학 분광기를 사용하여 기록된 파란색, 녹색, 빨간색 및 보라색 조명의 방출 스펙트럼을 보여줍니다. 연구에 사용된 청색, 녹색, 적색 및 보라색 LED 조명의 최대 흡광도에 해당하는 파장은 각각 465, 529, 632 및 405nm입니다. LED 칩은 조사 실험 중에 장치를 가열 할 수 있습니다. 각각의 실험에서 전체 광반응 시스템을, 따라서, 온도가 25 ± 3°C로 일정하게 유지되는 방에 두었다.

2. FMN의 광분해에 대한 광 파장의 영향(그림 3)

  1. 100 mM 인산칼륨 완충액(PB)(pH 7.8) 중 0.1mM FMN 용액을 준비한다. FMN 샘플(각각 3mL)을 파란색, 녹색, 빨간색 또는 보라색 빛에 10W/m2 의 강도로 5분 동안 노출시킵니다. 대조군으로 3mL의 FMN 용액을 어두운 곳에 보관하십시오.
  2. UV/가시광선 분광광도계를 사용하여 250-750nm 범위에서 조사된 FMN 샘플의 흡광도를 기록합니다.

3. 니트로 블루 테트라 졸륨 (NBT) 환원 검출 방법 figure-protocol-1 (그림 4).

참고: 여기에 사용된 NBT 환원법은 리보플라빈 광반응에 대한 분석에서 약간 수정되었습니다. NBT 환원 방법은 FMN 광분해로부터 생성된 수준을 figure-protocol-2 평가하기 위해 사용된다. 광화학적으로 여기된 FMN은 먼저 L-메티오닌에 의해 세미퀴논으로 환원된 다음 전자를 산소에 제공하여 31을 figure-protocol-3 생성합니다. 생성 figure-protocol-4 된 NBT는 560 nm32에서 특징적인 흡광도를 갖는 포르마잔으로 감소시킨다.

  1. PB 73.3mL(100mM, pH 7.8)에 109.3mg의 L-메티오닌을 추가합니다. 용액을 와동시켜 L-메티오닌을 용해시킨다.
  2. L- 메티오닌이 완전히 용해 된 후 NBT 분말 10mg과 0.117mM FMN 1.53mL를 용액에 첨가합니다. 적용된 반응 용액 (즉, FMN, L- 메티오닌 및 NBT의 혼합물)의 각 1mL에 대해, FMN, 메티오닌 및 NBT의 최종 농도는 각각 2.4 x 10-6M, 1.0 x 10-2M 및 1.6 x 10-4M이다.
  3. 반응 용액(1mL)을 10W/m2 의 청색 또는 보라색 LED 광선 조사에 1-5분 동안 노출시킵니다.
  4. 광화학 반응에 의해 생성 된 종 (560 nm에서의 흡광도에서)을 검출하여 NBT를 감소시키고 포르 마잔을 figure-protocol-5 생성합니다.

4. FMN 광분해 후 S. 아우레우스 생존율(그림 5)

  1. S. 아우레우스(BCRC 10451)의 콜로니를 배양 플레이트에서 15mL 스크류 캡이 있는 시험관에 담아 취한 10mL의 리소제니 액체로 전달합니다. 37°C에서 16시간 동안 진탕기에서 배양한다.
  2. 배양액 0.5mL를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 멸균된 물을 원심분리 튜브에 추가하여 배양물을 600nm(OD600)(~6 x 107CFU /mL)에서 0.5의 광학 밀도로 희석합니다.
  3. 배양물 0.5mL를 1.5mL 원심분리 튜브에 옮기고, 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 디캔트하여 세포 펠렛을 얻었다.
  4. 1 mL의 FMN-완충 용액 (PB 중의 30, 60, 및 120 μM FMN)을 단계 4.3에서와 같이 수득된 세포 펠릿에 첨가하고, 와동시킨다. 조사 제어를 위해 PB 단독 1mL를 추가하십시오.
  5. 30μM FMN 및 PB 단독을 포함하는 생존 가능한 박테리아 세포 용액 각각 1mL를 유리관에 옮기고 10W/m2 에서 30분 동안 보라색 빛을 조사합니다.
  6. 30, 60 및 120 μM FMN 및 PB 단독을 포함하는 생존 가능한 박테리아 세포 용액 1mL를 유리관에 옮기고 20W/m2 에서 120분 동안 청색광을 조사합니다. 120μM FMN을 포함하는 1mL의 생존 가능한 박테리아 세포 용액으로 다른 유리관을 설치하고 20W/m2 의 청색광을 60분 동안 조사합니다.
  7. 4.5단계와 4.6단계에 설명된 대로 시험관을 설치하고 두꺼운 알루미늄 호일로 덮습니다. 이 튜브는 어두운 컨트롤 역할을합니다.
  8. 30-120 분의 조사 기간 동안 9 ± 1 ° C의 차가운 실내에서 조사 챔버 (및 어두운 제어 장치)를 유지하십시오.
    알림: 컵 내부에 배치된 LED 칩이 조사 실험 중에 광반응 시스템을 가열할 수 있으므로 LED 조명에서 방출되는 열을 무시할 수 없습니다. 따라서, 실험은 9 ± 1°C로 유지되는 냉장실에서 수행되었다.
  9. 조사 후, 각각의 반응 용액으로부터 0.2 mL를 루리아 한천 (LA) 플레이트로 옮긴다. L자형 유리 막대로 플레이트 위에 박테리아를 퍼뜨리고 37°C에서 밤새 배양합니다.
  10. 하룻밤 성장 후 S. aureus 의 생존 가능한 판 수와 비활성화 비율을 계산합니다.
    참고 : S. aureus 의 비활성화 율은 [1-I / D] ×100 %와 동일한 백분율 감소로 계산되며, 여기서 I 및 D 는 각각 조사 된 샘플과 어두운 대조군의 CFU 수를 나타냅니다. 백분율 감소는 비활성화 비율의 음수 값으로 정의됩니다.

5. S. 아우 레우스의 검출 figure-protocol-6 (그림 6) 

  1. 단계 4에 설명된 대로 S. 아우레우스 샘플을 준비합니다.
  2. 멸균된 물로 샘플의 박테리아 밀도를 600nm에서 0.5의 광학 밀도로 희석합니다(OD600, ~6 x 106CFU /mL). 배양액 0.5mL를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 디캔트하여 세포 펠렛을 얻었다.
  3. 0.1093 g의 L- 메티오닌, 0.1 g의 NBT 및 25 mL의 FMN (400, 240 또는 120 μM)을 75 mL의 PB에 첨가하십시오. 적용된 반응물 1mL당 FMN, 메티오닌 및 NBT의 최종 농도는 각각 100(60 또는 30) x 10-6M, 7.3 x 10-3M 및 1.2 x 10-3M입니다.
  4. 1mL의 각 반응물 용액(즉, 다양한 FMN 농도로)을 단계 5.2에서와 같이 얻은 세포 펠릿에 추가합니다. 10 분 동안 10 W / m2 에서 보라색 빛으로 용액을 조사하십시오.
  5. 혼합물을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 디캔트합니다. 펠릿을 1mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 재현탁시켜 환원된 NBT를 추출합니다. 560 nm에서의 흡광도로부터 생성된 figure-protocol-7 종을 검출한다.

6. 통계 분석

  1. 데이터를 세 가지 독립 검정의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현합니다.
  2. 호모세다스틱 2표본 t-검정을 적용하여 두 측정값이 서로 다른지 여부를 평가합니다. p-값이 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

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결과

FMN에 대한 광 파장의 영향
청색, 녹색, 적색 및 보라색 LED를 사용하여 조사되는 0.1mM FMN의 흡광도 스펙트럼은 그림 3에 나와 있습니다. 어두운 제어를위한 FMN (372 nm 및 444 nm)에 대한 두 개의 피크가 있습니다. 녹색광과 적색광은 스펙트럼의 변화가 중요하지 않기 때문에 효과가 없습니다. 한편, 444nm에서 FMN의 흡광도는 10W/m2 에서 5분 동안 청색광과 보라색 광을 조사한 후 각각 약 19% 및 34% 감소하여 청색/보라색 광을 조사하면 FMN 광분해가 증가함을 시사합니다.

감지 figure-results-1 청색 또는 보라색 빛을 사용하여 조사되는 FMN에서<...

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토론

감광제는 화합물의 광화학 반응을 증가시켜 ROS를 생성합니다. 병원성 미생물은 감광제의 존재하에 광 조사에 의해 불 활성화 될 수있다. 이 연구는 외인성 감광제 인 FMN의 보라색 광 조사에 의해 생성 된 ROS로 인한 S. aureus의 aPDI 를 결정합니다.

그림 3에서 볼 수 있듯이 FMN의 경우 보라색 또는 청색광을 사용하여 5 분 동안 조사하면 444nm에서의 흡광도가 크게 감소하고 녹색 또는 적색광으로 조사해도 FMN 흡광도에는 큰 변화가 없습니다. NBT 환원은 전하 전달 과정(10, 33)을 통한 형성을 figure-discussion-1 결정하는데 사용...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 실험을 지원해 준 Tak-Wah Wong 박사와 Zong-Jhe Hsieh 씨에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
파란색, 녹색 및 빨간색 LED 조명Vita LED Technologies Co., Tainan, TaiwanDC 12 V 5050
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich, St. Louis, MO190186
적외선 온도계Raytek Co. Santa Cruz, CAMT4
LB 국물Difco Co., NJ
L-MethionineSigma-Aldrich, St. Louis, MO1.05707
NBTBio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supplyChina tech Co., New Taipei City, TaiwanYP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphateSigma-Aldrich, St. Louis, MOR7774
RNaseNew England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meterTenmars Electronics Co., Taipei, TaiwanTM-207
황색포도상구균 아종 아우레우스생물자원 수집 및 연구 센터(BCRC), 신주, 대만10451
UV-Vis 광학 분광계Ocean Optics, Dunedin, FLUSB4000
UV-Vis 분광 광도계Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, JapanU-2900
Violet LEDLong-hui Electronic Co., LTD, 둥관, 중국

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