방법 논문

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

DOI:

10.3791/63544

⸱

2022년 4월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

초록

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기도 조직에 대한 반복적 인 손상은 폐 기능을 손상시키고 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 만성 폐 질환을 일으킬 수 있습니다. 재생 의학 및 생물 반응기 기술의 발전은 약물을 스크리닝하고, 질병을 모델링하고, 조직 교체를 엔지니어링하는 데 사용할 수있는 실험실 성장 기능 조직 및 장기 구조물을 생산할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에서, 시험관내 조직 조작 및 배양 동안 외식화된 래트 기관지의 내강을 계내에서 시각화할 수 있게 하는 이미징 양식과 결합된 소형화된 생물반응기가 설명된다. 이 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직 매트릭스의 본질적인 생화학적 특징과 울트라구조를 보존하면서 내인성 세포 성분의 영상화 유도 선택적 제거를 입증한다. 더욱이, 계내에서 광학 모니터링을 갖는 탈세포화된 기도 루멘 상의 외인성 세포의 전달, 균일한 분포, 및 후속적인 연장된 배양이 도시된다. 이 결과는 영상-유도된 생물반응기가 잠재적으로 기능적인 시험관내 기도 조직의 생성을 용이하게 하는데 사용될 수 있다는 것을 강조한다.

서론

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호흡기의 발광 표면은 주로 다중 섬모, 클럽, 잔 및 기저 줄기 세포 1,2로 구성된 상피 층으로 줄 지어 있습니다. 상피층은 폐의 주요 방어 메커니즘 역할을하며, 흡입 된 병원균, 미립자 또는 화학 가스로부터 기저기도 조직을 보호하는 생물 물리학 적 장벽 역할을합니다. 그것은 세포 간 단단한 접합 형성, 점액 균 클리어런스, 항균 및 항산화 분비 3,4를 포함한 여러 메커니즘을 통해기도 조직을 보호합니다. 결함이있는기도 상피는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)5, 원발성 섬모 운동 장애 (PCD)6 및 낭포성 섬유증 (CF)7과 같은 치명적인 호흡기 질환과 관련이 있습니다.

폐 온 칩 (LOC) 기술의 발전은 인간의 폐 발달을 연구하고, 다양한 폐 질환을 모델링하고, 엄격하게 조절되는 체외 환경에서 새로운 치료 물질을 개발할 수있는 기회를 나타냅니다. 예를 들어, 기도 상피 ....

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프로토콜

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아래의 동물 조직 프로토콜은 스티븐스 공과 대학 (Stevens Institute of Technology)의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 동물 복지 지침 및 규정에 의해 승인되었으며 실험 동물 사용에 대한 NIH (National Institutes of Health) 지침을 준수합니다.

1. 영상 유도 쥐 기관지 생물반응기의 설계 및 시공

  1. 쥐 기관 생물반응기의 설계 및 제작
    1. CAD 생성기 소프트웨어를 사용하여 입구, 출구 및 조직 배양 챔버와 같은 관련 설계로 생물반응기 챔버의 CAD(컴퓨터 지원 설계) 모델을 만듭니다. 이 연구에서는 그림 1A-C에 제시된 형상과 치수를 사용합니다. CAD 생성기 소프트웨어의 튜토리얼은16,17에서 찾을 수 있습니다.
    2. 생성 된 CAD 모델을 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 컨트롤러 소프트웨어로 내보내고 CNC 기계를 사용하여 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 플라스틱을 절단하여 생물 반응기 챔버를 만듭니다. CNC 컨트롤....

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결과

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GRIN 렌즈 기반의 현장 이미징 양식은 현장에서 기관 내부 루멘의 시각화를 허용 할 수 있습니다 (그림 5A). 이 이미징 방법을 사용하면 천연 및 탈상피화 기관의 밝은 필드 및 형광 이미지를 모두 얻을 수 있습니다 (그림 5B, C). CFSE 표지 이전에 천연 기관지로부터 형광 신호가 관찰되지 않았다(도 5Bii). 그러나, 기관 상피를 CFSE 염료로 표지하였을 때, 상피 전체에 걸쳐 균일한 형광 신호(녹색)가 관찰되었다(도 5Ci). SDS를 통한 탈상피화 및 진동 보조 기도 관개 후, 형광 신호의 강도가 유의하게 감소하였고(도 5Cii), 상피의 절제를 나타낸다.

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토론

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이 작업에서, 우리는 (i) 세포 제거 및 외인성 세포 전달 후 계내에서 기관 내강의 모니터링과 (ii) 세포 시딩된 기관 조직의 장기 시험관내 배양을 허용할 수 있는 이미징 유도 생물반응기를 만들었습니다. 이 맞춤형 생물반응기를 사용하여, 우리는 (i) 세제 및 진동 보조 기도 세척을 사용하여 기관 내강으로부터 내인성 상피 세포를 선택적으로 제거하고 (ii) 세포가 로딩된 콜라겐 I 프리젤을 사용하여 외인성 세포를 탈착된 기관의 발광 표면으로 균일하게 분포시키는 것을 시연했습니다. 또한, GRIN 렌즈 기반 이미징 양식은 현장에서 상피의 제거를 확인했다. 또한 H&E, 삼색, 오각형, 면역형광염색, SEM을 포함한 추가 분석을 통해 상피의 제거와 기저 조직층의 구조와 성분의 유지를 확인하였다. 또한, 새로 이식된 외인성 중간엽 줄기세포의 GRIN 렌즈 기반 영상화는 콜라겐 I 프리젤이 전달 비히클로서 사용되었을 때 세포의 균일한 분포를 보여주었다. 마지막으로, 이식된 세포는 탈상.......

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공개 사항

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저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 흉부 학회 재단 연구 프로그램, 뉴저지 건강 재단 및 국립 과학 재단 (CAREER Award 2143620)이 J.K.에 부분적으로 지원했습니다. 그리고 국립 보건원 (P41 EB027062)에서 G.V.N.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1&시간; PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
3포트 커넥터World Precision Instruments14048-20
4포트 커넥터World Precision Instruments14047-10
가속도계STMicroelectronicsIIS3DWBTR
Achromatic doubletThorlabsAC254-150-A-ML
알루미늄 핀 스텁TED PELLA16111
항생제-항진균제Thermo Fisher Scientific15240062
어셈블리 로드ThorlabsER1
버튼 헤드 나사McMaster-Carr91255A274
케이지 큐브ThorlabsC4W
탄소 양면 전도성 테이프TED PELLA16073
CFSE 라벨링 키트Abcamab113853
Citrisolv (투명화제),Decon1061
C-마운트 어댑터ThorlabsSM1A9
Collagen I, Advanced BioMatrix5153
전도성 리퀴드 실버 페인트, TED PELLA16034
이색성 거울SemrockDI03-R488반사 레이저 파장:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco의 변형된 Eagle' s mediumGibco, Thermo Fisher Scientific11965118
암 루어 격벽-호스 미늘 어댑터Cole-ParmerEW-45501-30
암 루어-튜빙 미늘Cole-ParmerEW-45508-03
암-수 루어 커넥터Cole-ParmerZY-45508-80
소 태아 혈청Gibco, Thermo Fisher Scientific10082147
필터 렌즈Chroma Technology CorpET535/50m
형광 현미경NikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
육각 너트McMaster-Carr91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
이미징 섬유SELFOC, NSG 그룹GRIN 렌즈
레이저옵토 엔진MDL-D-488-150mW
렌즈 튜브ThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD 생존력/세포 독성 키트(Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 CNC 제어 소프트웨어Newfangled Solutions
대물 렌즈OlympusUCPLFLN20X
연동 펌프Cole ParmerL / S 표준 디지털 펌프 시스템
재조합 인간 FGF - 기본PeproTech100-18B
고정 링ThorlabsSM1RR
Scientific CMOS 카메라PCO 팬더PCO 팬더 4.2
도데 실황산나트륨VWR97064-472
솔리드웍스 ( 2019)다쏘시스템è mes
스택형 렌즈 튜브ThorlabsSM1L10
서브우퍼 플레이트 앰프Dayton AudioSPA250DSP
서브우퍼 스피커Dayton AudioRSS21OHO-4다이어프램 직경: 21cm
주사기 펌프세계 정밀 기기AL-4000
스레드 케이지 플레이트ThorlabsCP33
스레드 루어 어댑터Cole-ParmerEW-45513-81
튜브 렌즈ThorlabsAC254-150-A-ML
Tygon 튜빙Cole-Parmer13-200-110
XY 변환기ThorlabsCXY1
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of N....

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재인쇄 및 허가

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