이 프로토콜은 Barth 증후군의 진단을 위해 백혈구 카디오리핀의 질량 분광법 "지문"을 얻는 방법을 보여줍니다. 모노리소카디오리핀과 카디오리핀 비율의 상승된 평가는 바르트 증후군 환자를 100% 민감도와 특이성을 가진 대조군 심부전 환자와 구별합니다.
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방법 논문
Barth 증후군의 신속한 진단을 위해 질량 분광법에 의한 백혈구의 카디오리핀 지문 채취
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
카디오리핀 (CL)은 그 구조에서 네 개의 지방산 사슬을 운반하는 이량체 인지질로, 미토콘드리아의 지질 마커이며, 여기서 내막의 기능에 중요한 역할을합니다. 그것의 대사 산물 monolysocardiolipin (MLCL)는 생리 학적으로 동물 세포의 지질 추출물에 거의 존재하지 않으며 그 외관은 유아기에 심각한 심근 병증을 일으키는 희귀하고 종종 잘못 진단 된 유전 질환 인 Barth 증후군 (BTHS)의 특징입니다. 여기에 기술된 방법은 "카디오리핀 지문"을 생성하고, 세포 지질 프로파일에서 CL 및 MLCL 종의 상대적 수준에 대한 간단한 검정을 허용한다. 백혈구의 경우, 혈액 철수로부터 2 시간 이내에 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (비행 시간 / 질량 분광법 (MALDI-TOF / MS) 를 통해 MLCL / CL 비율을 측정하기 위해 1 mL의 혈액 만 필요합니다. 이 분석은 간단하며 BTHS를 스크리닝하기 위해 임상 생화학 실험실의 일상적인 작업에 쉽게 통합 될 수 있습니다. 이 검사는 BTHS에 대한 100 % 민감도와 특이성을 보여 주므로 적합한 진단 테스트입니다.
서론
바르트 증후군 (BTHS)은 조기 발병 심근병증, 골격근 근병증, 성장 지연, 호중구 감소증, 가변 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 장애 및 비정상적인 미토콘드리아 구조 1,2,3,4,5를 특징으로 하는 드문 X 연결 질환이다. BTHS는 현재 전 세계적으로 250 건 미만의 알려진 사례가있는 백만 명의 남성 당 한 건의 사례가 유병률을 보였지만 2,6 건의 과소 진단이 가능하다는 것은 널리 받아 들여지고 있습니다. BTHS는 염색체 Xq28.127,8에 국한된 타파진(TAFAZZIN) 유전자의 기능 상실 돌연변이로 인해 미토콘드리아 인지질 카디오리핀(CL)의 결핍된 리모델링을 야기하며, 이는 일반적으로 고도로 대칭적이고 불포화된 아실 조성물
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프로토콜
건강한 기증자 및 심부전 환자의 혈액 샘플은 바리 (이탈리아)의 폴리 클리닉 병원에서 수집되었으며, BTHS 환자의 샘플은 브리스톨 왕립 아동 병원 (영국)의 국립 보건 서비스 영국 BTHS 클리닉에서 수집되었습니다. 건강한 기증자, 환자 및 부모 (적절한 경우)의 서면 동의와 각 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
참고 : 즉시 사용하지 않으면 혈액 (K-EDTA 젤 튜브)을 4 °C에서 최대 24-48 시간 동안 저장할 수 있습니다.
1. 적혈구(RBCs)의 덱스트란 침강에 의한 백혈구의 분리
- 혈액 샘플 (K-EDTA)을 궤도 쉐이커에 10 분 동안 넣어 혈액을 혼합하십시오.
- 1.5 mL 튜브에서 전혈 0.9 mL에, 0.1 mL의 20% 덱스트란 용액(분자 질량 > 100 kDa, 0.9% NaCl 중)을 첨가한다. 피펫을 착용하고 서스펜션을 부드럽게 20회 분산시키면서 튜브 상단에 RBC를 유지하는 기포를 피하십시오. RBCs를 실온에서 약 1 시간 동안 침전시킨다.
- 주사기를 사용하여, 황색 상청액을 수집하여 15 mL 튜브로 옮긴 다음, 실온에서 15분 동안 400 x g 에서 원심분리한다....
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결과
이 연구에서는 1mL의 전혈에서 백혈구를 분리하고 MALDI-TOF/MS에 의한 CL 지문 채취를 얻는 간단하고 신속한 방법이 설명되었습니다( 그림 2 참조). 도 3 은 CL 및 MLCL 질량(m/z) 범위에서 대조군 피험자와 BTHS 어린 소년으로부터 수득된 백혈구의 대표적인 CL 핑거프린팅의 비교를 보여준다. 표 1은 이들 질량 스펙트럼에서 검출된 CL 및 MLCL 종을 열거한다.
TAFAZZIN 유전자의 결함은 전형적으로 BTHS에 특이적인 지질 프로파일, 즉 CL 지문에서 CLm 형태의 감소와 함께 MLCL 및 CLi 형태의 출현을 결정한다. 대조군 피험자의 백혈구의 지질 프로파일은 전형적으로 CLm의 단지 두 개의 분자 종만을 나타낸다(도 3의 상부 패널). 이 질.......
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토론
바르트 증후군은 신진 대사의 선천적 인 오류이며 과소 진단 될 가능성이있는 삶을 변화시키는 상태입니다 2,6. 앞서 언급했듯이, 기여 요인은 간단한 진단 테스트의 부족 일 수 있습니다. 여기에서는 BTHS 스크리닝을 위해 백혈구에서 MALDI-TOF/MS에 의한 MLCL/CL 비율을 측정하는 간단하고 빠른 방법이 설명되었다. 또한, MALDI-TOF 질량 분광계는 전 세계 임상 실험실에 널리 분포되어 있으며 높은 분석 전문 지식31,32을 필요로하지 않습니다.
현재의 방법은 단리된 백혈구의 총 지질 프로파일에서 CL 및 MLCL 종을 MS 분석의 단일 실행에서 동시에 검출할 수 있고, HPLC를 통한 표준 지질 추출 및 분리의 시간이 많.......
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공개 사항
모든 저자들은 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 우리의 연구에 참여한 BTHS와 그 가족들에게 감사드립니다. 우리는 Barth Syndrome Foundation U와 Barth Syndrome UK Trust가 브리스톨에서 열린 연례 회의에서 혈액 샘플 수집을 지원하고 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus 및 Apulia Region이 자금을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준 |
| 1,1′ 2,2′-tetra-(9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준 |
| 1,2-di-(9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준물 |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준물 |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준물 |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준물 |
| 2-Propanol, ACS 시약, ≥ 99.5% | 머크 생명과학 S.r.l. | ||
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros 유기물 | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS 시약, ≥ 99.5% | 머크 생명과학 S.r.l. | ||
| 클로로포름, ACS 시약, ≥ 99.8% | 머크 생명과학 S.r.l. | ||
| 319988 Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| 플렉스 분석 3.3 | Bruker Daltonics | 소프트웨어 | |
| MALDI-TOF 질량 분석기 Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | 소프트웨어 | |
| OmniPur 10X PBS 액체 농축액 | Merck Life Science Srl. | 6505-OP | |
| 염화칼륨, ACS 시약, 99.0-100.5% | Merck Life Science Srl | P3911 | |
| 염화나트륨, ACS 시약, ≥ 99.0% | 머크 생명과학 무역 | S9888 |
참고문헌
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al.
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재인쇄 및 허가
