방법 논문

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

DOI:

10.3791/63586

⸱

2022년 4월 21일

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, 2Department of Anatomy & Cell Biology, The George Washington University

이 논문에서

요약

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여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.

초록

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세포가 조직과 기관을 생성함에 따라 분자 사건의 특성화는 정상적인 발달을 더 잘 이해하고 질병에 대한 효율적인 치료법을 설계할 수 있는 잠재력을 높입니다. 다양한 유형과 많은 수의 단백질을 정확하게 식별하고 정량화할 수 있는 기술은 공간과 시간에서 조직과 유기체 발달을 조율하는 분자 메커니즘에 대한 정보를 여전히 제공하지 못할 것입니다. 여기에서 우리는 Xenopus laevis (개구리) 배아에서 확인된 세포 계통에서 수천 개의 단백질을 측정할 수 있는 질량 분석 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 재현 가능한 세포-운명 지도와 이 척추동물 발달 모델에서 세포와 그 자손(클론)을 식별, 형광 표지, 추적 및 샘플링하는 확립된 방법을 기반으로 합니다. 마이크로 샘플링을 사용하여 세포 내용물을 수집하거나 해부 또는 형광 활성화 세포 분류를 통해 세포를 분리한 후 단백질을 추출하고 처리하여 상향식 단백질체학 분석을 수행합니다. 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동은 고분해능 질량분석법(HRMS)을 통해 단백질 검출 및 정량화를 위한 확장 가능한 분리를 제공하는 데 사용됩니다. 대표적인 예가 신경-조직 운명 세포의 프로테오믹 특성화에 대해 제공된다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 다양한 조직과 유기체에 적용할 수 있습니다. 척추동물 발달 동안 프로테옴의 시공간적 역학을 들여다보기에 충분히 민감하고 구체적이며 정량적입니다.

서론

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세포 분화와 조직 및 기관의 기원에 대한 우리의 이해는 수십 년 동안 유전자와 그 산물에 대한 정교한 표적 스크리닝의 결과입니다. 중요한 세포 사건 동안 모든 생체 분자와 그 양에 대한 지식을 늘리면 척추 동물 신체 계획의 공간적 및 시간적 패턴을 제어하는 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 분자 증폭 및 시퀀싱을 가능하게 하는 기술은 이제 많은 수의 유전자와 전사체에 대해 일상적으로 보고할 수 있어 기초 생물학 및 중개 연구에서 가설 기반 연구를 지원합니다. 개발 중인 시스템을 이해하기 위해 전사와 번역 간의 복잡한 관계는 여러 단백질의 직접 분석과 번역 후 변형을 지지합니다. 유도만능줄기세포와 같은 시험관 내 생물학적 시스템을 사용하는 글로벌 단백질체학은 조직 유도 1,2의 메커니즘을 설명하기 시작했습니다. 척추동물 배아와 같은 복잡한 유기체에서 발달은 공간과 시간의 맥락에서 모르포겐 구배에 의존한다3. 따라서 세포가 분화하여 신경 조직과 같은 특수 조직을 형성함에 따라 단백질체학적 변화에 대한 지식을 얻는 것은 정상 및 결함 발달을 제어하는 분자 프로그램을 잠금 해제하고 차세대 치료법을 안내하는 열쇠를 제공합니다....

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프로토콜

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Xenopus laevis 성체 개구리의 인도적 유지 및 취급을 보장하는 모든 프로토콜은 메릴랜드 대학교 칼리지 파크의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 R-DEC-17-57 및 R-FEB-21-07).

1. 솔루션 준비

  1. 발생학의 경우
    1. 1x, 0.5x 및 0.2x Steinberg's solution(SS)을 준비한 다음 표준 프로토콜 12에 따라 멸균(120분 동안120°C)하여 오토클레이브(20분)합니다.
    2. 표준 프로토콜 3에 따라 멸균된 1x SS에서12%(w/v) Ficoll을 준비합니다.
    3. 탈젤을 위해 2%(w/v) 시스테인 용액을 새로 준비하고 10M 수산화나트륨 용액을 한 방울 떨어뜨려 pH를 8로 조정합니다.
      주의: 시스테인에 노출되면 피부와 호흡기 손상을 일으킬 수 있습니다. 수산화나트륨은 직접 노출되면 피부와 눈에 심각한 손상을 줄 수 있는 부식성입니다. 장갑 및 실험실 코트와 같은 이러한 화학 물질을 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오.
    4. 계보 추적자의 ....

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결과

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이 프로토콜은 단일 세포에서 단백질과 X. laevis 배아에서 조직을 확립할 때 그 계통에 대한 연구를 가능하게 했습니다. 그림 1은 신경-조직 운명 세포와 배아에서 새로 유도된 신경 외배엽에서 단백질을 연구하기 위한 접근 방식의 이러한 적용 중 하나를 보여줍니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이 생물 분석 워크플로는 세포를 식별, 주입/흡인하고 표본을 수집하기 위해 세포 및 발달 생물학의 전통적인 도구를 통합했습니다. 도 1B는 마이크로인젝터를 사용하여 생체 내에서 좌측 등쪽 동물(D11) 세포 16-세포 배아의 마이크로프로브 샘플링을 도시한다; 실험 후, 배아는 정상적인 해부학적 56을 가진 올챙이로 성공적으로 발달했습니다. 큰 배아 세포(직경 ~100-250μm)도 수동 미.......

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토론

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이 프로토콜은 Xenopus 종의 배아에서 확인된 세포 계통에서 단백질 발현의 특성화를 가능하게 합니다. HRMS에서 비롯된 이 방법론은 분자 식별의 정교한 특이성, 분자 프로브 없이 다중 단백질 검출 기능(일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질) 및 정량 기능을 결합합니다. 세포 및 발달 (신경) 생물학의 고전적인 도구 및 워크플로우에 대한 적응성은 척추동물 X. laevis 배아에서 줄기 세포 분화의 전체론적 특성 분석을 포함하여 HRMS 단백질체학을 흥미로운 응용 분야로 확장합니다.

이 단계는 X. laevis 배아의 세포 계통 유도 단백질체학을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 신경 운명 단일 세포와 그 계통의 분석을 시연하고 공개 데이터 저장소를 통해 해당 CE 및 nanoLC HRMS 데이터 세트를 제공합니다(PROUD 참조). 이 접근법은 여러 세포 유형(및 계통)에서 단백질의 시공간 조절에 대한 연구에 쉽게 적.......

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공개 사항

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저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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배아 해리 및 FACS에 대한 귀중한 토론을 해주신 Jie Li (University of Maryland, College Park)에게 감사드립니다. 이 프로토콜에서 강조된 단백질체학 응용 분야를 예시하는 이전 연구에서 샘플 준비 및 데이터 수집에 도움을 준 Vi M. Quach와 Camille Lombard-Banek에게 감사드립니다. 이 연구의 일부는 수상 번호 IOS-1832968 CAREER(PN으로), 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 수상 번호 R35GM124755(PN), 메릴랜드 대학교-국립 암 연구소 파트너십 프로그램(PN) 및 COSMOS Club Foundation 연구 상(ABB 및 LRP)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴(LC-MS 등급)Fisher ScientificA955
아가로스ThermoFisher ScientificR0492
중탄산암모늄Fisher ScientificA643-500
분석 컬럼Thermo Scientific164941
분석 마이크로저울Mettler-ToledoXSE105DU
자동 펩타이드 분획 플랫폼: Agilent1260 Infinity II
붕규산 모세 필라리Sutter Instruments Co.B100-50-10
붕규산 모세 필러리(이미터 제조용)Sutter InstrumentsB100-75-10
C18 스핀 컬럼(탈염용)ThermoFisher Scientific89870
카메라 및 모니터 전기 스프레이Edmund Optics Inc.EO-2018C
Combretastatin A4Millipore SigmaC7744
상업용 CESI 시스템AB SCIEXCESI
(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)VWR97061-492
Cytochalasin DMillipore SigmaC8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, 음이온성, 고정성ThermoFisher ScientificD22910
DiothiothreitolFisher ScientificFERR0861
Dumont #5 펜치파인 사이언스 도구11252-30
EDTAFisher ScientificAAJ62786AP
Epifluorescence 광원LumencoreAURA III
Eppendorf LoBing 마이크로 원심분리기  튜브: 단백질Fisher Scientific13-698-793
포름산 (LC-MS 등급)Fisher ScientificA117-50
냉동고 (-20 ° C)피셔 사이언티픽97-926-1 
냉동고 (-80 ° C)Thermo ScientificTSX40086A
용융 실리카 모세관Molex1088150596
Heat Block벤치 마크BSH300
고압 액체 크로마토 그래피 시스템ThermoFisher ScientificDionex Ultimate 3000 RSLC 나노 시스템
고전압 전원 공급장치 SpellmanCZE1000R
고분해능 질량분석기ThermoFisher ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량분석기
HPLC capsThermo ScientificC4013-40A
HPLC 바이알Thermo ScientificC4013-11
조명기 예: 구즈넥NikonC-FLED2
Ingenuity Pathway AnalysisQiagen
요오드아세트아미드Fisher ScientificAC122275000
메탄올 (LC-MS 등급)Fisher ScientificA456
메탄올 (LC-MS 등급)Fisher ScientificA456-4
마이크로모세관 풀러서터 기기P-2000
마이크로인젝터워너 기기, Handem, CTPLI-100A
마이크로피펫 풀러Sutter Instruments Co.P-1000
MS 데이터 분석 소프트웨어, 상용ProteomeDiscoverer
MS 데이터 분석 소프트웨어, 오픈 소스MaxQuant
non-idet 40 대체Millipore Sigma11754599001
Petri dish 60mm 및 80mmFisher ScientificS08184
Pierce 10 µ L 침대 지퍼 팁(탈염용)ThermoFisher Scientific87782
Pierce 비신코닌산 단백질 분석 키트ThermoFisher Scientific23225
Pierce 정량 비색 펩타이드 분석ThermoFisher Scientific23275
Pierce 트립신 프로테아제(MS 등급)Fisher ScientificPI90058
단백질 LoBind 바이알Eppendorf0030108434
, 0030108442
냉장 원심분리기Eppendorf5430R
냉장 인큐베이터Thermo ScientificPR505755R/3721
이세티오네이트 나트륨밀리포어 밀리포어 시그마220078
피로인산나트륨Sigma Aldrich221368-100G
스테인리스 스틸 BGE 바이알
스테인리스 스틸 샘플 바이알맞춤형
스테레오현미경 (목표 10x)NikonSMZ 1270, SZX18
SucroseVWR97063-790
주사기 펌프 (2)Harvard Apparatus704506
Syringes (gas-tight): 500– 1000 &마이크로; LHamilton1750TTL
트랜스퍼 피펫 (플라스틱, 일회용)Fisher Scientific13-711-7M
트랩 컬럼Thermo Scientific164750
Tris-HCl (1 M 용액)Fisher ScientificAAJ22638AP
진공 농축기 4&ndash에서 작동 가능; 10 > CLabconco7310022
Vortex-mixer벤치마크BS-VM-1000
물(LC-MS 등급)Fisher ScientificW6
물(LC-MS 등급)Fisher ScientificW6
XYZ 번역 스테이지ThorlabsPT3
XYZ 번역 스테이지맞춤형 제작
, , 품 맞춤형

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
  2. Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their ....

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