이 원고의 목적은 마우스에서 이종 후두 이식을 수행하는 데 필요한 미세 수술 단계를 설명하는 것입니다. 후두 이식의 다른 동물 모델과 비교하여이 마우스 모델의 장점은 비용 효율성과 면역 학적 분석 및 데이터의 가용성입니다.
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방법 논문
후두 이식 연구를 위한 이종 마우스 모델
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
후두 이종 이식은 기술적으로 어려운 절차이지만 다른 동물 모델에 비해 더 과학적인 분석과 비용 이점을 제공합니다. 2009 년 Shipchandler et al.에 의해 처음 설명되었지만,이 기술은 미세 수술 기술을 배우는 데 어려움과 그것을 습득하는 데 필요한 시간으로 인해 널리 사용되지 않습니다. 이 백서에서는 이 기술의 효과적인 사용을 장려하기 위해 수술 단계와 피해야 할 잠재적인 함정에 대해 자세히 설명합니다.
이 모델에서 기증자 후두의 양측 경동맥은 수용자 경동맥과 외부 경정맥에 문합되어 이식편을 통한 혈류를 허용합니다. 혈류는 이식편 양측 경동맥의 혈액 충전, 이식편의 갑상선 붉어짐, 이식편의 미세 혈관 출혈의 시각화를 통해 수술 중 확인할 수 있습니다. 성공을위한 중요한 요소에는 이식 혈관의 섬세한 보존, 올바른 크기의 동맥 절개술 및 정맥 절개술, 동맥 동맥 및 동맥 정맥 문합에 적절한 수의 봉합사를 사용하여 누출없이 혈관을 고정하고 폐색을 방지하는 것이 포함됩니다.
누구나 충분한 교육을 통해 이 모델에 능숙해질 수 있으며 약 3시간 내에 절차를 수행할 수 있습니다. 성공적으로 수행되면 이 모델을 통해 면역학적 연구를 쉽고 저렴한 비용으로 수행할 수 있습니다.
서론
돌이킬 수없는 후두 손상 또는 후두암으로 고통받는 환자의 경우 전체 후두 절제술이 종종 유일한 옵션1입니다. 전체 후두 절제술은 환자가 스스로 숨을 쉬고 말할 수 없는 상태로 만들고 사회적,심리적 고통을 경험하게 합니다2. 전체 후두 절제술이 필요한 후두암 환자는 후두 이식의 훌륭한 잠재적 후보입니다. 돌이킬 수없는 후두 손상 환경에서 인간 후두 이식이 수행되었지만 종양 재발에 대한 두려움, 만성 거부 반응 가능성 및 기증자 유래 감염3으로 인해 현재 이러한 환자에서 후두 동종 이식이 피됩니다. 면역 억제는 이러한 우려의 주요 원인입니다. 종래의 면역억제 치료 후 종양 재발로 인한 첫 번째 부분 후두 이식 환자의 극적인 손실은 후두암 환자에서 이식을 위한 추가 시도가 이루어지기 전에 적절한 면역억제 요법이 고안되어야 한다는 증거입니다4,5.
이식 된 후두에 대한 숙주 면역 반응을 더 잘 이해하기 위해 1992 년 Strome에 의해 쥐의 첫 번째 후두 이식 모델이 개발되었으며 수술 기술이 2002 년에 개선되었습니다 6,7. 이 모델은 후두 이식을 연구하는 데 효과적이지만, 쥐 특이 적 면역 약제의 부족 및 쥐 모델과 관련된 높은 비용으로 인해 2009 년 후두 이식을 연구하기위한 새로운 마우스 모델이 개발되었습니다8.
설명 된 기술의 주요 적용은 후두 이식에서 다양한 면역 억제 약물 요법을 연구하는 것입니다. 현재의 면역억제 요법을 개선하면 후보 풀을 넓히고 암 환자의 안전한 이식으로 이어질 수 있습니다. 이 마우스 모델의 이점은 비용 효율성과 면역학적 데이터 및 시약의 광범위한 가용성입니다.
후두 이식을 위한 면역억제 치료 요법을 연구하는 팀은 이 방법을 사용하여 대량의 면역학적 데이터를 수집할 수 있으며 다양한 약물 요법을 신속하게 테스트하고 비교할 수 있습니다. 줄기 세포 주사와 같은 이식에 대한 면역 반응을 조절할 수있는 다른 잠재적 인 치료 양식도이 모델을 사용하여 테스트 할 수 있습니다. 마지막으로, 추적 기간을 연장하여 후두 이식의 장기적인 전신 효과를 관찰하기위한 실험을 고안 할 수 있습니다.
여기에 설명된 기술은 종단 간 문합을 사용하여 이종 후두 이식편에 동맥 및 정맥 흐름을 제공합니다. 이식편은 기증자의 후두, 갑상선, 부갑상선, 기관 및 식도로 구성된 후두 기관 식도 (LTE) 복합체이며 양측 경동맥과 척추는 손상되지 않았습니다. 하나의 기증자 경동맥은 수혜자 경동맥에 문합되어 동맥 혈류를 제공하는 반면, 다른 기증자 경동맥은 수혜자 외부 경정맥에 문합되어 정맥 혈류를 제공합니다 (그림 1).
마우스 모델에서 성공을 보장하기 위해 래트 모델의 수술 기술에 몇 가지 수정이 이루어졌습니다. 예를 들어, 마취 깊이에 대한 제어를 높이고 합병증을 줄이기 위해 주사제 대신 흡입 마취제를 사용했습니다. 연속 봉합은 쥐의 동맥 - 동맥 문합에 사용됩니다. 그러나, 마우스 혈관의 크기가 작기 때문에, 이것은 기술적으로 어렵고 혈관 내강7의 협착을 야기 할 수있다. 결과적으로, 중단 된 봉합사가 마우스 모델에서 사용되어 혈관 개통 성을 향상시킵니다. 또한 쥐 모델에서 상 갑상선 동맥 (STA) 척추가 해부되고 시각화됩니다. 마우스에서 STA의 크기가 더 작기 때문에 이러한 해부는 STA의 손상 및 심지어 절개를 초래할 수 있습니다. 결과적으로 마우스 모델에서 해부되지 않습니다. 대신, STA가 손상되지 않도록 근처의 근막이 보존됩니다.
이 기술의 주요 잠재적 함정에는 기증자 LTE 복합 척추 손상, 잘못된 크기의 동맥 절개술 또는 정맥 절개술, 문합 부위의 혈관 폐색 또는 출혈을 유발할 수 있는 문합 부위에 틈을 남기는 것이 포함됩니다. 이러한 실수를 방지하려면 STA 척추 주위에 조직 커프를 남겨 두어 기증자 이식편을 조달할 때 주의를 기울여야 합니다. 동맥 절개술과 정맥 절개술은 혈류를 허용할 만큼 충분히 커야 하지만 누출을 방지할 수 있을 만큼 작아야 합니다. 문합이 틈을 막기 위해 적절한 수의 봉합사를 사용해야하지만 혈관을 막기에는 너무 많지 않아야합니다.
미세 수술 기술에 익숙해지면이 절차를 약 3 시간 내에 수행 할 수 있습니다. 이 후두 이식 모델은 마우스에서 안정적으로 수행 할 수 있으며 혈관 화 복합 동종 이식 후 숙주 면역 반응을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
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프로토콜
이 연구는 Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 따라 수행되었습니다. BalbC 마우스 (10-12 주령)를 기증자로 사용하고 C57 / BL6 마우스 (10-12 주령)를 수용자로 사용했는데, 이는 주요 조직 적합성 복합체 인 H-2Db 및 H-2Kb가 각각 면역 학적으로 호환되지 않아 이식편에 대한 면역 반응을 추가로 연구 할 수 있기 때문입니다. 수술 중에 사용 된 모든기구는 멸균되었으며 (보충 그림 S1 및 보충 그림 S2 참조), 수술 분야는 IACUC 지침에 따라 프로토콜 전반에 걸쳐 멸균 상태로 유지되었습니다.
1. 기증자 수술 및 이식편 조달
- 시술을 시작하기 30 분 전에 기증자에게 연장 방출 부 프레 노르 핀 (3.25mg / kg 체중)을 피하 주사하십시오. 설치류 마취 상자에 마우스를 넣고 1 L/minO2 흐름으로 전달된 3% 이소플루란에서 마취 유도를 한다. 동물이 완전히 마취 된 후, 마우스를 면도 부위로 옮기고 마취 유지를 위해 1 L / min O2 흐름으로 1.5 % 이소 플루 란을 투여한다. 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인하십시오.
- 마우스의 가슴과 목을 턱선까지 면도하고 탈모 크림을 바르십시오. 30 초 후 물에 적신 멸균 거즈 패드로 크림을 닦아내고 마우스를 수술 부위로 옮깁니다.
- 마우스의 눈에 눈 윤활제를 바르십시오. 적절한 체온을 보장하기 위해 드레이프된 보조 가열 패드에 마우스를 놓습니다.
- 마우스를 고정시키고 포비돈 요오드와 알코올로 수술 부위를 세 번 준비한 다음 마우스를 드레이프합니다.
알림: 발가락 핀치로 마취 깊이를 확인하고 시술 전반에 걸쳐 안면 마스크를 통해 1.5% 이소플루란 및 1L/min O2 흐름으로 마취를 유지하십시오. - 흉골 상부 노치보다 우수한 작은 수평 절개를 만드십시오. 가는 가위를 사용하여 그 절개를 통해 피부를 하악골까지 양측으로 들어 올립니다. 사다리꼴 모양의 피부 부분을 절제하여 양측 타액선, 흉골 유돌근, 이위 근육 및 흉골의 상복부가 노출됩니다(그림 2A).
- 샘을 통해 이동하는 작은 정맥이 시각화되는 상부 부분에서 소작을 사용하여 양측 타액선을 절제합니다(그림 2A).
알림: 샘을 제거하기 전에 혈관을 소작하는 데 주의를 기울이지 않으면 이 단계에서 심각한 출혈이 발생할 수 있습니다. - 림프 및 지방 조직을 측면으로 부드럽게 수축시켜 흉골 유양 돌기와 스트랩 근육을 노출시킵니다. 주변 조직에서 양측 흉골 유양 돌근을 해부하고 견인기를 사용하여 측면으로 수축시킵니다.
알림: 이 조작은 스트랩 근육이 있는 LTE 복합체를 완전히 노출시키고 경동맥 해부를 위한 편안한 작업 공간을 제공합니다(그림 2B). - 스트랩 근육 사이에 정중선을 절개하고 양측으로 절제하여 밑에있는 갑상선을 손상시키지 않도록주의하고 LTE 복합체에 남겨 둡니다.
참고: 이 단계 후에 양측 경동맥이 보여야 합니다(그림 2C). - 총 경동맥을 쇄골 수준까지 열등하게 그리고 경동맥 분기 수준까지 우월하게 해부합니다. 경동맥에서 미주 신경과 내부 경정맥을 해부하십시오. 조달 된 이식편에 포함하지 마십시오.
참고: 상부 갑상선 동맥은 내측으로 이동하는 분기점보다 약간 우월한 것으로 볼 수 있습니다. 이 혈관을 둘러싼 얇은 근막은 그대로 두고 원주방향으로 해부하려고 하지 마십시오. 이 혈관은 LTE 복합체에 혈류를 공급하고 이식 후 척추 역할을합니다. 이 선박의 보존이 가장 중요합니다. - 내부 및 외부 경동맥을 결찰하고 분열 할 수있을만큼 충분히 멀리 해부하십시오. 혈관의 시각화에 어려움이있는 경우 별도의 견인기를 사용하여 이위 근육을 옆으로 수축시킵니다.
알림: 상부 갑상선 동맥의 손상을 방지하기 위해 분기점에 더 가까운 외부 경동맥을 해부하지 마십시오. 이 단계에서 외부 경동맥에서 분기되어 내 경동맥과 평행하게 이어지는 후두 동맥을 만날 수 있으며 더 크고 더 깊게 발견되는 내 경동맥과 혼동해서는 안됩니다 (그림 2D). - 8-0 사용 나일론 봉합사는 경동맥 분기보다 우수한 2 내지 3 mm 내경동맥을 결찰한다. 상부 갑상선 동맥의 분기점보다 최소 3mm 우수한 외부 경동맥을 결찰하십시오.
참고: 이러한 결찰 후 LTE 복합체는 상부 갑상선 동맥을 통해 양측 경동맥으로 척추를 긋습니다. - 흉골 수준에서 총 경동맥을 결찰하고 모든 결찰 혈관을 양측으로 절단하십시오. 추가 해부 중에 우발적 인 손상을 방지하기 위해 LTE 복합체 위에 혈관 척추를 유지하십시오. 가스 누출이나 부주의한 마취 상실을 방지하려면 기도 절단을 하기 전에 동물이 만료되었는지 확인하십시오.
- 설골 수준에서 하부 근육을 나눕니다. 설골보다 열등한 전방 인두 절개술을 만듭니다. 절개 부위를 추척전 근막까지 옮겨 LTE 복합체를 우수하게 자유롭게합니다.
- 다섯 번째 기관 링 아래의 기관을 횡단하고 절개를 식도를 통해 추척 전 근막으로 운반하여 LTE 복합체를 열등하게 제거합니다. 기관과 식도를 밑에있는 추추 전 근막에서 열등한 방향에서 상급 방향으로 자유롭게하십시오.
알림: 추가 해부 중에 우발적 인 손상을 방지하기 위해 LTE 복합체 위에 혈관 척추를 유지하십시오. - 설골보다 열등한 전방 인두 절개술을 만듭니다. 절개 부위를 추척전 근막까지 옮겨 LTE 복합체를 우수하게 자유롭게합니다. 나머지 림프 또는 결합 조직 부착물을 LTE 복합체와 주변 조직 사이에 나눕니다. 이식편을 제거하십시오.
참고: 이식편에는 기증자 후두, 기관, 갑상선, 부갑상선, 식도 및 후두 근육이 복합 단위로 포함되어 있습니다(그림 2E).
2. 이식편 준비
- 조달 된 이식편을 멸균 된 페트리 접시에 넣고 일반 식염수로 씻어 혈전을 제거하십시오. 마이크로 포셉을 사용하여 양측 경동맥에서 혈액과 응고를 부드럽게 젖을 짜냅니다. 1mm 미세 확장기를 사용하여 양측 경동맥을 확장하십시오.
- 30G의 무딘 바늘을 사용하여 각 경동맥에 약 2mL의 헤파린화 식염수를 주사하여 이식편을 플러시합니다.
참고: 혈액과 식염수가 반대쪽 경동맥과 작은 자유 혈관 끝에서 흘러나오는 것을 볼 수 있으며, 이는 온전한 상부 갑상선 동맥을 확인합니다. - 동맥 끝에서 외막을 절제하여 문합을 위한 깨끗한 가장자리를 갖도록 합니다.
참고: 이식편은 헤파린화된 식염수에 남겨둘 수 있으며 수혜자9에게 이식하기 전에 최대 3시간 동안 짧은 휴식을취할 수 있습니다.
3. 수혜자 수술 및 혈관 문합
- 마취 유도, 면도, 및 수술 준비 단계에 이어 공여자에 대해 기재된 것과 동일한 방법으로 수용자 마우스를 준비한다. 수술 시작 30분 전에 수혜 마우스에게 연장 방출 진통제를 피하 주사합니다.
- 메스를 사용하여 턱선에서 흉골까지 아래쪽으로 연장되는 정중선 목 절개를하십시오. 왼쪽의 피부를 들어 올리고 옆으로 집어 넣습니다.
- 왼쪽 타액선을 절제하여 앞서 설명한대로 상부 혈관을 소작하십시오. 눈에 보이는 혈관을 저온 소작으로 나누어 지방과 림프 조직을 절제하고 밑에있는 외부 경정맥을 손상시키지 않도록주의하십시오 (그림 3A).
- 외부 경정맥을 원주 방향으로 해부하십시오. 문합을 위해 최소 5mm의 투명 혈관 길이를 사용하십시오. 저온 소작 또는 결찰을 사용하고 경정맥에서 분기되는 비교적 큰 정맥을 나눕니다.
- 흉골 유돌근을 해부하고 옆으로 수축시킵니다. 견인기와 직접 접촉하지 않도록 해부 된 정맥을 근육 뒤에 보호하십시오.
- 받는 경동맥에 접근하기 위해 왼쪽 스트랩 근육을 절제하십시오. 쇄골에서 경동맥 분기점까지 총 경동맥을 원주 방향으로 우월하게 해부합니다 (그림 3B).
- 외부 경정맥 아래에 배경 재료를 통과시키고 이중 근사 V3 용기 클램프를 적용합니다.
- 원하는 정맥 절개술 위치에 외부 경정맥의 전벽을 통해 10-0 나일론 봉합사를 놓고 이 봉합사를 사용하여 앞쪽으로 당겨 혈관을 텐트로 만듭니다.
- 적절한 크기의 단일 슬릿 정맥 절개술을 만들 수있을만큼 충분히 깊은 미세 가위로 봉합사를 자르고 절단이 정맥벽을 완전히 통과하도록합니다.
- 30G의 뭉툭한 바늘을 사용하여 헤파린 처리 된 식염수로 정맥 내부를 씻어냅니다.
- 공여 LTE 복합체를 수혜자 좌경동맥과 좌측 외경정맥 사이에 위치시킨다. 기증자 왼쪽 경동맥의 자유 끝을 수혜자 왼쪽 외부 경정맥쪽으로 맞추고 날카로운 가위로 혈관 끝을 경사지게합니다.
- 4 개의 10-0 나일론 중단 봉합사를 사용하여 기증자 왼쪽 경동맥과 수혜자 왼쪽 외부 경정맥을 종단 간 방식으로 문합합니다.
- 수혜자 총경동맥 아래로 배경 자료를 밀고 이중 근사 A3 혈관 클램프를 수혜자 총경동맥에 놓습니다. 정맥 절개술과 같은 방식으로 동맥 절개술을 만듭니다.
알림: 동맥 절개술이 기증자 경동맥의 내강과 같은 크기인지 확인하십시오. 너무 크면 클램프를 제거한 후 심한 출혈이 발생합니다. 너무 작 으면 이식편으로의 혈류가 막힙니다. - 6개의 10-0 나일론 중단 봉합사를 사용하여 종단 간 방식으로 기증자 오른쪽 경동맥을 수혜자 왼쪽 경동맥에 문합합니다.
알림: 올바른 미세 혈관 기술은 혈관 문합 전반에 걸쳐 존중되어야합니다. 뒷벽을 통과하면 혈류가 상당히 수축되어 이식편의 생존을 위협합니다. 혈관의 크기가 작기 때문에 봉합사를 다시하는 것은 매우 어렵습니다. - 정맥 쪽의 클램프를 제거하십시오. 출혈이 발생하면 면봉으로 부드럽게 압력을 가하십시오.
- 동맥의 클램프를 제거하고 즉시면 팁으로 부드러운 압력을가하십시오.
알림: 이 단계에서 약간의 출혈이 예상되며 일반적으로 부드러운 압력으로 1분 후에 멈춥니다. - 동맥과 정맥의 혈류 무결성을 확인하십시오.
참고: 온전한 동맥 흐름으로 기증자 경동맥의 맥동이 일반적으로 나타나고 기증자 갑상선이 플러시된 투명한 색에서 원래의 붉은 색으로 다시 바뀝니다. LTE 단지에있는 작은 혈관의 붉은 색도 관찰 할 수 있습니다. - 헤파린 화 된 식염수로 수술 부위를 관개하고 5-0 모노 필라멘트 봉합사로 피부 절개를 닫으십시오. 절개 부위에 항생제 연고 또는 피부 접착제를 바르십시오.
- 수술 중 체액 손실을 고려하여 따뜻한 식염수 1mL를 피하에 주입합니다.
- 마취를 멈추고 마우스를 회복 케이지로 옮깁니다. 저체온증을 피하기 위해 완전히 깨어날 때까지 가열 패드에서 마우스를 관찰하십시오.
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결과
성공적인 이식 확인
상술한 프로토콜을 사용하여, 혈관 클램프를 제거한 후 공여 경동맥의 맥동을 관찰함으로써 LTE 복합체로의 혈류를 평가할 수 있다. 맥동은 일반적으로 볼 수 있으며 기증자 동맥의 즉각적인 붉은 색은 활성 혈류를 확인합니다 (그림 4A). 문합이 효과적이지 않으면 동맥에 맥동이 없고 부분적으로 붕괴된 것처럼 보이며 색이 옅어집니다(그림 4B).
동맥 개통을 확인하는 또 다른 기술은 클램프를 제거한 후 기증자 갑상선의 색 변화를 찾는 것입니다. 갑상선의 색이 창백한 색에서 빨간색으로 변하는 것은 몇 분 안에 볼 수 있습니다. 기증자 갑상선의 우엽도 동맥 흐름으로 붉어집니다. 이와 대조적으로, 동맥 쪽에서 더 멀리 떨어진 왼쪽 엽은 적절한 흐름을 받는 데 더 오래 걸립니다. 공여자 LTE 복합체 상의 말단의 작은 자유 혈관을 ...
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토론
후두암의 발병률과 유병률은 지난 30 년 동안 각각 12 %와 24 % 증가했으며,이 환자들 중 많은 사람들이 치료10을 위해 후두 절제술을받습니다. 이 절차는 사람의 삶의 질을 크게 악화 시키므로 대체 치료가 필요합니다. 후두의 혈관 화 된 복합 동종 이식은 환자의 호흡 및 말하기 능력을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 이 기술이 이 환자 집단에 임상적으로 활용되기 전에 연구가 여전히 필요합니다. 이 논문은 다양한 면역 억제 요법의 조사를 가능하게 할 수 있는 비용 효율적인 후두 이식 마우스 모델을 제공합니다.
이 절차에는 수술의 성공을 좌우할 수 있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 기증자의 경우 척추 손상을 피하기 위해 상 갑상선 동맥에서 해부를 멀리하는 것이 중요합니다. 후두를 조달 할 때 척추를 보호하고 혈관의 비틀림을 피하기 위해 상부 갑상선 동맥 주위에 근막 커프를 남겨 두는 것도 중요합니다. 식염수로 이식편을 플러시 할 때...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다. Egehan Salepci의 연구 여행 및 생활비는 터키 과학 기술 연구위원회 (TUBITAK)에서 자금을 지원했습니다.
감사의 글
Randall Raish의 뛰어난 비디오 촬영 및 편집 지원에 감사드립니다.
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재료
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참고문헌
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