방법 논문

말초 신경 공학을 위한 그래핀 기반 3D 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 준비 및 특성화

DOI:

10.3791/63622

⸱

2022년 5월 16일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고에서 우리는 말초 조직 공학에 사용하기 위해 그래핀을 함유하는 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 제조를 시연합니다. 이 3D 바이오 하이브리드 재료를 사용하여 줄기 세포의 신경 분화 프로토콜이 수행됩니다. 이것은 유사한 생체 재료를 클리닉에 가져 오는 중요한 단계가 될 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

말초 신경 병증은 축삭 손상의 결과로 발생할 수 있으며 때로는 탈수 초성 질환으로 인해 발생할 수 있습니다. 말초 신경 손상은 응급 환자의 1.5%-5%에서 발생하는 세계적인 문제이며 상당한 실직으로 이어질 수 있습니다. 오늘날 스캐폴드, 적절한 세포주 및 생체 신호로 구성된 조직 공학 기반 접근 방식은 3차원(3D) 바이오프린팅 기술의 발전으로 더욱 적용 가능해졌습니다. 다양한 하이드로겔 생체 재료와 줄기 세포, 엑소좀 또는 생체 신호 분자의 조합은 말초 신경 재생의 기존 문제를 극복하기 위해 자주 연구되고 있습니다. 따라서, 하이드로겔과 같은 주사 가능한 시스템, 또는 다양한 바이오프린팅 방법에 의해 형성된 이식형 도관 구조의 생산은 말초 신경 공학에서 중요성을 얻고 있다. 정상적인 조건에서 줄기 세포는 신체의 재생 세포이며 개체군을 보호하기 위해 시간이 지남에 따라 수와 기능이 감소하지 않습니다. 이들은 특수 세포는 아니지만 부상에 대한 반응으로 적절한 자극으로 분화 할 수 있습니다. 줄기 세포 시스템은 줄기 세포 틈새 시장이라고 불리는 미세 환경의 영향을 받고 있습니다. 말초 신경 손상, 특히 신경망증에서 이 미세 환경은 절단된 신경 말단을 외과적으로 결합한 후에도 완전히 구출될 수 없습니다. 복합 생체 재료 및 결합 된 세포 치료 접근법은 생분해 성, 생체 적합성 및 가공성과 같은 다양한 특성 측면에서 재료의 기능성과 적용 가능성을 높입니다. 이에 본 연구는 그래핀 기반 바이오하이브리드 하이드로겔 패터닝의 제조 및 용도를 입증하고, 신경 재생에 효과적인 해결책이 될 수 있는 줄기세포의 신경세포로의 분화 효율을 알아보는 것을 목적으로 한다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유기체와 환경의 내부 구조를 연결하는 메커니즘 인 신경계는 중추 신경계와 말초 신경계의 두 부분으로 나뉩니다. 말초 신경 손상은 응급실에 내원하는 환자의 1.5%-5%를 차지하는 세계적인 문제이며 다양한 외상으로 인해 발생하여 상당한 실직을 초래합니다 1,2,3.

오늘날 말초 신경 공학에 대한 세포 접근법은 큰 관심을 끌고 있습니다. 줄기 세포는 이러한 접근법에 사용되는 세포 중 가장 먼저 나옵니다. 정상적인 조건에서 줄기 세포는 신체의 재생 세포이며 개체군을 보호하기 위해 시간이 지남에 따라 수와 기능이 감소하지 않습니다. 이 세포들은 특수화되어 있지만, 손상에 대한 반응으로 적절한 자극에 의해 분화할 수 있다 4,5. 줄기 세포 가설에 따르면, 줄기 세포 시스템은 줄기 세포 틈새 (stem cell niche)라고 불리는 미세 환경의 영향을받습니다. 줄기세포의 보존과 분화는 세포와 스캐폴드7를 이용한 조직공학을 통해 재구성될 수 있는 미세환경6의 존재 없이는 불가능하다. 조직 공학은 공학과 생물학 원리를 모두 포함하는 다학문 분야입니다. 조직공학은 생체 조직을 대체할 수 있는 인공 조직을 만들 수 있는 도구를 제공하며, 손상된 조직을 제거하고 기능성 조직을 제공함으로써 이러한 조직의 재생에 사용될 수 있다8. 조직 공학의 세 가지 초석 중 하나인 조직 스캐폴드는 천연 및 합성 재료와 다른 방법을 사용하여 생산된다9. 3차원(3D) 프린팅은 다양한 방법을 사용하여 복잡한 모양을 간단하지만 다재다능하게 생산하여 결함 조직을 대체하거나 복원하는 데 널리 사용되는 새로운 적층 제조 기술입니다. 바이오프린팅은 세포와 생체 재료의 공존을 가능하게 하는 적층 제조 방법으로, 바이오잉크(bioinks)라고 불린다 10. 신경 세포가 서로 상호 작용하는 것을 고려하여 연구는 그래핀과 같은 전도성 생체 재료 후보로 이동했습니다. 플렉시블 일렉트로닉스, 슈퍼 커패시터, 배터리, 광학, 전기화학 센서 및 에너지 저장과 같은 특성을 갖는 그래핀 나노플레이트는 조직 공학 분야에서 선호되는 생체 재료이다11. 그래핀은 손상된 조직과 장기의 증식과 재생이 수행된 연구에 사용되어 왔다12,13.

조직 공학은 스캐폴드, 세포 및 생체 신호 분자의 세 가지 기본 구성 요소로 구성됩니다. 말초 신경 손상에 대한 연구는이 세 가지 구조를 완전히 제공한다는 점에서 결함이 있습니다. 줄기 세포 또는 생체 신호 분자만을 포함하는 생체 재료, 줄기 세포 분화를 가능하게하는 생리 활성 분자의 부족, 사용 된 생체 재료의 생체 적합성 부족, 조직 틈새 세포의 증식에 대한 낮은 영향, 따라서 신경 전도가 완전히 실현되지 않습니다 2,13,14,15,16. 이를 위해서는 신경 재생의 최적화, 근육 위축(17,18)의 감소, 그리고 이러한 문제에 대한 성장 인자를 가진 필요한 귀환(19)을 생성해야 한다. 이 시점에서, 임상으로 이송 될 외과 생체 재료 프로토 타입의 신경 활성의 특성화 및 분석은 매우 중요합니다.

따라서이 방법 연구는 3D 바이오 프린터로 형성된 그래 핀 나노 플레이트를 사용한 바이오 잉크 하이드로 겔 패터닝과 그것이 포함하는 줄기 세포의 신경성 분화에 미치는 영향을 조사합니다. 또한, 그래핀이 신경구 형성 및 분화에 미치는 영향을 조사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 와튼젤리 중간엽 줄기세포의 배양

  1. Wharton's jelly mesenchymal stem cells(WJ-MSC, ATCC의 제품)를 -80°C 냉동고에서 꺼냅니다. Yurie et al.20에 기재된 바와 같이, 실온에서 멸균 층류에서 10% 태아 송아지 혈청(FBS), 1% Pen-Strep 및 1% L-글루타민을 함유하는 DMEM-F12 배지에서 WJ-MSC를 배양한다.
  2. 35% FBS, 55% DMEMF-12 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하는 동결 배지를 사용하여 일부 세포를 1 x 106 cells /mL로 냉동 보존합니다. 이를 위해 Thoma 세포 카운팅 슬라이드에서 1 x 106 세포를 계수하고 냉동 용액을 적가합니다. 슬라이드를 액체 질소 용기로 빠르게 옮깁니다.
  3. 배양된 세포가 플라스크에서 80% 합류하면 배지를 붓고 5mL의 PBS로 세척합니다. 5mL의 0.25% 트립신과 2.21mM EDTA-4Na를 추가합니다. 37°C의 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 인큐베이터에서 꺼낸 세포에 10% FBS가 포함된 DMEM-F12 배지 10mL를 추가합니다. 잘 매달고 매체를 모으고 매체를 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  5. 실온에서 5분 동안 101 x g 의 회전 속도로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 10% FBS를 함유한 신선한 영양 배지로 새 플라스크에 세포를 다시 시딩합니다.
    참고: 형질도입 방법에 의해 GFP 유전자로 표지된 상업용 WJ-MSC는 생산될 생체 재료-세포 상호작용을 더 잘 시각화하는 데 사용할 수 있습니다21. 이 방법에서 사용할 그룹은 표 1과 같이 생성할 수 있습니다.

생성된 그룹만드는 이유담당자 수
2차원 WJ-MSC(2D-C)2D 제어엑스 5
2D WJ-MSC 및 그래핀 (2D-G)2D에서 그래핀 독성 선량 측정x 서로 다른 농도로 5회 반복
WJ-MSC는 바이오잉크(3D-B)에 포함되어 있습니다.3D 제어엑스 3
WJ-MSCs 및 0.1 % 그래 핀은 바이오 잉크 (3D-G)에 포함되어 있습니다.3D 그래핀-바이오잉크 바이오하이브리드 그룹엑스 3
WJ-MSC는 바이오잉크(3D-BS)에서 스페로이드 형태입니다.스페로이드 형태의 3D 제어엑스 3
바이오잉크의 WJ-MSC 및 0.1% 그래핀 아레인 스페로이드 형태(3D-GS 그룹)3D 그래핀-바이오잉크 스페로이드 형태의 바이오하이브리드 그룹x3
3D 바이오잉크 드롭SEM 및 FTIR 특성화 분석을 위해 생산됩니다.x5
3D 그래핀 드롭SEM 및 FTIR 특성화 분석을 위해 생산됩니다.x5
GFP 표지 WJ-MSCs & 0.1%를 함유한 3D 바이오잉크적절한 용량의 그래핀을 함유한 바이오잉크에서 WJ-MsC의 움직임 관찰.x3

표 1. 메서드의 그룹입니다. 메서드의 모든 2D 및 3D 그룹이 포함됩니다.

2. 그래핀 독성 및 2D 이미징

  1. 그래핀 농도의 제조 및 세포에의 적용
    참고 : 원시 그래 핀 나노 입자는 상업적으로 구입되었으며 (산업용 그래 핀 나노 플레이트 유형) 기증되었습니다. 입자의 치수는 두께 5-8 nm, 직경 5 μm, 표면적 120-150m2/g이었다.
    1. 그래핀의 무게를 측정하여 1% 용액(mg/mL)을 만듭니다. 100μg의 그래핀 나노입자에 10% FBS가 포함된 DMEMF-12 배지 10mL를 첨가하여 원액을 만들고 이 용액을 원액으로 라벨링합니다. 오토클레이브에서 121°C의 1.5기압 압력으로 20분 동안 살균합니다.
      알림: 멸균 그래핀 혼합물은 사용할 때까지 4°C의 냉장고에 보관됩니다. 장기간 사용(최대 1개월)에는 적합하지 않을 수 있습니다. 이 경우 혼합물을 재구성하고 멸균해야합니다.
    2. 무독성 용량을 결정하기 위해 다양한 농도의 중간 그래핀 혼합물을 준비합니다. 초기 희석액을 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 및 0.0001% 그래핀/매체로 설정합니다.
    3. 1% 원액으로 시작하여 각 농도에서 1mL를 연속적으로 취하여 새 튜브로 옮깁니다. 10% FBS가 함유된 DMEMF-12 배지 9mL를 각 튜브에 추가하여 점진적으로 희석된 5개의 샘플을 만들고 용액을 흔들고 소용돌이쳐 균등하게 분배합니다. 대조군으로 10% FBS가 있는 DMEMF-12 배지 10mL만 사용하십시오.
      참고: 그래핀의 무거운 플레이크는 침전되므로 재분배되어야 합니다.
    4. WJ-MSC를 웰당 5 x 105 세포 에서 10% FBS를 함유하는 2mL의 신선한 배지와 함께 6웰 플레이트에 시딩합니다. 37°C에서 1일 동안 배양한다. 그런 다음 판을 동일하고 반복되는 우물 그룹으로 나눕니다. 각 농도에 대해 5 회 반복하십시오.
    5. 배지를 폐기한 다음 배지를 웰당 2mL의 그래핀 배지 농도로 교체합니다. 대조군에 대해서는 배지만 사용하십시오. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.
  2. MTT를 이용한 그래핀의 무독성 농도 측정
    1. 24시간 후에 그래핀으로 배지를 폐기합니다. PBS로 각 우물을 씻으십시오. 웰당 2mL의 10% FBS가 있는 신선한 DMEMF-12 배지를 추가합니다.
      참고: 세포내이입에 의해 세포 내로 흡수되지 않는 그래핀 나노입자가 환경에서 제거되기 때문에 세포에 그래핀 농도를 적용한 후 PBS로 세척하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 MTT 테스트가 더 효율적입니다.
    2. MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드) 프로토콜을 사용하여 Kose et al.22 및 단계 2.2.3.-2.2.6에 설명된 대로 50% 세포 생존율을 나타내는 IC50 값을 결정합니다.
    3. 먼저 MTT 염 5mg/mL의 무게를 측정하고 PBS에 녹입니다. 0.45μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 15mL 원심분리기 튜브에서 만든 MTT 용액을 알루미늄 호일로 싸서 4°C에서 보관합니다.
    4. 10 μL의 MTT를 모든 웰에 첨가하고 플레이트를 37°C에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후 현미경으로 10x 배율로 포르마잔 결정의 형성을 관찰합니다.
    5. 세포에 형성된 결정을 용해시키기 위해 100 μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하고 피펫팅으로 혼합한다. 접시를 실온에서 30분 동안 어두운 곳에 두십시오. 플레이트를 ELISA 플레이트 리더에 삽입합니다. 흡광도 측정을 위해 프로그램에서 파장을 570nm로 설정하고 플레이트(22)를 읽게 합니다.
      참고: 또한, 그래핀 입자 단독은 270nm(23)에서 판독되는 반면, 여기서 570nm(24 )의 판독 범위는 세포 생존율만을 판독하기 위한 것이다.
    6. 통계 분석 프로그램에서 Tukey의 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 얻은 결과에 대한 통계 분석을 수행합니다.
  3. 스티치 이미징
    1. 서로 다른 그래핀 농도와 세포의 상호 작용을 검사하려면 스티치 이미징(stitch imaging)이라는 방법으로 세포의 타임랩스를 수행합니다. 이 방법은 현미경으로 일정한 간격으로 촬영한 이미지 샘플을 사용하여 타임랩스 이미지를 생성합니다.
    2. 이렇게하려면 먼저 컴퓨터를 켭니다. 타임랩스 이미징 인큐베이터를 켜고 37°C로 설정합니다. MTT 플레이트를 타임랩스 인큐베이터 슬롯에 놓습니다.
    3. 컴퓨터에서 Stitch 프로그램을 엽니 다. 시스템에서 읽을 웰을 지정합니다. 판독기를 첫 번째 우물로 가져가 백색광에서 10배 배율로 해당 영역을 찾아 초점을 맞춥니다. 프로그램을 시작합니다.
      참고 : 고품질 4 행 x 5 열 다중 사진 콜라주를 만드는 프로그램입니다. 이 프로그램은 HD 화질로 차례로 찍은 사진을 결합합니다. 시스템 시작 버튼을 누르면 웰이 자동으로 읽히고 4 행 x 5 열 여러 장의 사진을 찍고 꿰매십시오.

3. 그래핀 - 바이오잉크 바이오하이브리드 하이드로겔 생산 및 WJ-MSCs 분화

  1. 바이오잉크 생산
    참고: 동결건조된 상업적으로 이용 가능한 알지네이트-젤라틴(3:5) 분말은 바이오잉크의 기초로 사용됩니다. 그래핀 바이오잉크군(3D-G; 3D-GS)과 그래핀이 없는 대조군 바이오잉크군(3D-B; 3D-BS)은 동일한 방법으로 제조된다(표 1).
    1. 준비를 위해 50mL 원뿔형 튜브를 사용하십시오. 먼저 알긴산 4.5mg과 젤라틴 1.5mg을 달아 원심분리관으로 옮긴다. 10% FBS를 함유하는 DMEMF-12 배지를 혼합물에 총 부피 50 mL로 첨가한다. 이것은 그래핀이 없는 대조군(C)군이다.
    2. 알긴산 4.5mg과 젤라틴 1.5mg의 무게를 반복하고 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 2.1.3 단계에서 제조된 0.1% 그래핀 50μL를 취한다. 튜브에 추가하십시오. 10% FBS가 포함된 DMEMF-12를 총 부피 50mL에 추가합니다.
    3. 바이오잉크를 먼저 피펫팅(pipetting)으로 혼합한 다음 소용돌이(vortex)로 혼합합니다. 오토클레이브에서 121°C의 1.5기압 압력으로 20분 동안 살균합니다. 또는 끓는점까지 전자레인지에 돌려 살균을 수행하십시오.
    4. 혼합물을 고압 증기 멸균 한 후, 실온에서 2 분 동안 280 x g 에서 원심 분리하여 형성된 기포를 제거한다. 세포가 준비될 때까지 바이오잉크를 37°C에서 보관합니다.
  2. WJ-MSC 및 3D 바이오프린팅 추가
    1. 계수를 위해, 대략 5 mL의 PBS와 80% 합류가 있을 때 세포를 세척하고, 5 mL의 0.25% 트립신 및 2.21 mM EDTA 4Na를 첨가한다. 37°C에서 5분간 방치한다.
    2. 인큐베이터에서 꺼낸 후 10% FBS가 함유된 DMEM-F12 배지 10mL를 세포에 첨가한다. 잘 매달고 매체를 모아 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 101 x g 로 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
    3. 펠릿과 함께 약 250 μL의 배지를 남겨 둡니다. 펠릿을 1mL의 신선한 배지에 재용해합니다. 48 μL의 배지에 2 μL의 세포 현탁액과 50 μL의 트리판 블루(0.4 g 트리판 블루/100 mL)를 원뿔형 튜브(1.5 mL)에 넣어 계수합니다4. 잘 피펫팅하십시오.
    4. 제조된 염색된 세포 현탁액 약 10mL를 토마 세포 계수 챔버에 첨가한다. 광학 현미경의 양쪽에 있는 사각형에 떨어지는 평균 세포 수를 계산합니다.
      활력 백분율(%) = (계수된 생존 세포/계수된 총 세포) x 100 계산
      참고 : 세포 - 바이오 잉크 상호 작용은 두 가지 방법으로 연구됩니다 : (1) 바이오 잉크 (3D-B; 3D-G)에 추가하여 인쇄 할 수 있습니다. (2) 세포를 압착 한 후 바이오 잉크에 시딩하고 세포는 스페로이드 (3D-BS, 3D-GS)를 형성합니다.
    5. 세포-바이오잉크 상호작용을 위해 먼저 바이오잉크 그룹을 생성한다(표 1). 그룹 1에는 바이오프린팅을 위해 바이오잉크로 인쇄된 3D-B 및 3D-G가 포함됩니다. 그룹 2에는 바이오프린팅 후 스페로이드가 형성된 3D-BS 및 3D-GS 바이오잉크가 포함됩니다.
    6. 0.5mL의 배지에 약 1 x 107 개의 세포가 있도록 그룹 1의 세포를 계산합니다. 바이오잉크 4.5mL를 넣어 총 부피를 5mL로 만듭니다. 주사기를 사용하여 멸균 캐비닛의 카트리지로 옮깁니다. 바이오프린터의 해당 압출기 섹션에 카트리지를 설치합니다.
    7. 두 번째 그룹의 경우 각 바이오 잉크 그룹에서 5mL를 가져 와서 인젝터를 사용하여 멸균 카트리지로 옮깁니다.
    8. 두 개의 동축 프린트 헤드와 공압 구동 압출 기술이 있는 바이오프린터를 사용하십시오. 마이크로스텝당 X/Y/Z 분해능을 1.25μm, 압출 폭을 400μm, 압출 높이를 200μm로 설정합니다. 20mm x 20mm x 5mm 그리드는 3D 바이오프린팅 작업에 가장 많이 사용되는 3D 모델 중 하나입니다.
    9. 오픈 소스 웹 기반 CAD 프로그램을 사용하여 3D 모델을 만듭니다. 바이오프린팅을 하기 전에 오픈 소스 플랫폼(예: infill) 중 하나를 사용하여 간단한 3D 모델을 만듭니다. 모델은 선형(여기에 사용된 모델과 같은), 벌집 모양 또는 그리드 모양일 수 있습니다. 5mm x 20mm x 20mm 정사각형을 만든 후 .stl 형식으로 내보내고 다운로드합니다.
    10. 바이오 프린터 소프트웨어는 .stl 파일을 사용하고 슬라이서 모듈을 사용하여 인쇄 가능한 .gcode 형식으로 변환합니다. 인쇄 가능한 그리드 모양을 얻으려면 슬라이서 모듈에서 외부 셸을 사용하지 않도록 설정합니다. 작동하기 전에 70% 에탄올로 장치를 닦은 다음 UV 살균으로 살균하십시오.
    11. 바이오프린팅 공정의 경우 인젝터를 사용하여 바이오잉크 그룹을 카트리지로 옮깁니다. 바이오프린터의 해당 압출기 섹션에 카트리지를 설치합니다.
    12. 3D 프린터의 평균 압력을 7.5psi로 설정하고 카트리지 및 베드 온도를 37°C로 설정합니다. 속도를 60%로 설정하고 표준 3D 프린팅 프로세스를 수행합니다.
      참고: 공간(예: 선형 모델)으로 준비된 모델을 계획하면 바이오프린팅 후 공간에서 세포 배양을 수행할 수 있습니다.
    13. 쓰기 단계에서 시스템을 홈 위치에 놓습니다. 축(X, Y, Z)을 자동으로 배치하고 압출기를 선택한 다음 설정합니다. 인쇄 프로세스를 시작합니다. 바이오프린팅 과정이 끝나면 샘플을 채취하여 층류 캐비닛 아래에 놓습니다.
    14. 인쇄 후 바이오잉크에 0.1NCaCl2 용액을 분무하거나 실온에서 피펫으로 용액 1mL를 추가합니다. 약 10-20초 동안 기다렸다가 인쇄된 패턴을 Ca 2+ 및 Mg2+가 포함된 PBS로 2배 세척합니다.
    15. 각 세포 함유 바이오잉크 그룹 위에 10% FBS 배지가 있는 DMEMF-12 2mL를 추가합니다. 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C에서 인큐베이션한다. 그 후, 스페로이드 형성을 위해 1 x 106 세포가 포함된 현탁 배지 2mL를 각 그룹에 추가합니다.
    16. 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C에서 인큐베이션한다. 24시간 배양 후 도립 현미경으로 스페로이드 형성을 관찰합니다.
  3. 뉴런 유사 세포로의 WJ-MSC 분화
    1. 배양 24시간 후 모든 바이오잉크 배치를 관찰하고 사진을 찍습니다. 웰당 신경성 분화 배지 2mL를 추가하고(대조군 제외) 2일마다 새로 고칩니다. 신경 분화를 관찰하기 위해 7일 동안 추적합니다.

4. 그래핀-바이오잉크 바이오하이브리드 하이드로겔 특성 분석

참고: 그래핀-바이오잉크 바이오하이브리드 하이드로겔의 특성화를 위해 타임랩스 이미징, 푸리에 변환 적외선 분광법(FT/IR) 및 주사전자현미경(SEM) 분석이 수행됩니다. 샘플은 FT/IR 및 SEM 분석을 위한 드립 방식으로 3D-B 및 3D-G 바이오잉크 그룹에서 생성됩니다.

  1. FT/IR 분석
    참고: FT/IR은 수학적 푸리에 변환을 기반으로 하는 화학 분석 방법으로 재료 특성화에 없어서는 안 될 필수 요소입니다. 할로겐 램프, 수냉식 수은 광원, 신호 종횡비 4cm-1, 2,200cm-1에서 1분 동안 측정된 28°C Michelson 간섭계 원리를 기반으로 하는 FT/IR 장치를 사용하십시오.
    1. FT/IR 현미경을 준비하고 기기의 광학 장치가 정렬되어 있는지 확인합니다. 장치를 보정합니다.
    2. 샘플이 한 방울에 있기 때문에 1-2mm 두께의 하이드로 겔 조각을 가져 와서 샘플 부분에 집게로 놓습니다. 샘플에 초점을 맞추고 밀접하게 접촉할 때까지 올립니다. 시스템에서 프로세스를 시작하여 샘플 스펙트럼을 수집합니다.
  2. 주사전자현미경(SEM) 분석
    참고: 표면 형태, 내부 구조, 세포 분포 및 바이오잉크-세포 상호 작용은 SEM 분석을 통해 다양한 차원에서 검사할 수 있습니다.
    1. 피펫 팁 액적 방법을 사용하여 1mL의CaCl2 가교제가 들어 있는 6웰 플레이트에 하이드로겔을 떨어뜨립니다( 그림 1 참조).
    2. 플레이트를 약 1 mL의 PBS로 2x 세척하여 염 용액을 유리화시킨다. 그런 다음 집게를 사용하여 5mL의 5% 파라포름알데히드가 들어 있는 팔콘 튜브에 이 방울을 넣습니다.
    3. 메스의 도움으로 드롭 바이오 잉크에서 얇은 섹션을 만듭니다. 금속판의 끈적끈적한 면에 샘플을 붙입니다. 공기를 아르곤 가스로 대체하여 플라즈마 상으로 통과하는 금 팔라듐이 샘플을 덮는 코팅 장치에 삽입합니다.
    4. 전자 현미경 (SEM)에 넣으십시오. SEM이 연결된 현미경 프로그램을 엽니다. 스케일링을 수행하고 샘플의 다른 부분의 이미지를 찍습니다. 이 프로토콜에는 5μm, 10μm 및 200μm 스케일이 사용되었습니다. 3D-B 및 3D-G 그룹에 대해 총 40개의 이미지가 촬영되었습니다.
  3. 타임랩스 이미징
    참고: 타임랩스 이미징 중에 GFP 유전자 형질전환 세포가 포함된 바이오잉크 샘플뿐만 아니라 스페로이드가 있는 바이오잉크도 16시간 동안 이미징되었습니다. 타임랩스 이미징은 줄기 세포에 대한 그래핀의 영향을 조사하고 바이오잉크 내의 세포 상호 작용을 모니터링하기 위해 수행됩니다.
    1. 3.2.11 단계에서와 같이 상업적으로 이용 가능한 1 x 107 GFP 표지 MSC를 5mL의 바이오잉크 및 바이오프린트에 추가합니다. 가교제 1mL를 넣고 20-30초 동안 유지한 다음 PBS로 2배 세척합니다.
    2. 타임랩스 모니터를 켜고 컴퓨터에서 프로그램을 엽니다. 타임랩스 모드에서 약 16시간을 설정하고 온도를 37°C로 설정합니다. 시작 버튼을 누릅니다. 40초 타임랩스 비디오 샘플 형태의 비디오가 시스템에 의해 녹화됩니다.
    3. 현미경의 초점을 2시간마다 10배 배율로 맞춥니다. 또한 동일한 단계에 따라 생성된 스페로이드를 시각화합니다.

figure-protocol-1
그림 1: 특성화에 사용하기 위해 방울로 생성된 3D-B 및 3D-G 바이오잉크 그룹. (A) 가교제가 있는 플레이트의 바이오잉크 샘플(사전 특성화 이미지). (B) 바이오잉크의 3D-B 드롭 이미지. (C) 3D-G 바이오잉크 드롭 이미지. 특성화 할 생체 재료와 포함 된 세포는 금도금, 샘플링 등과 같은 공정을보다 쉽게 거칠 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 면역염색법에 의한 신경성 분화 확인

  1. 구체 형태를 방해하지 않고 스페로이드를 수집하고 조직 절편을 위해 파라핀을 매립하는 대신 더 쉬운 방법으로 염색하기 위해 새 플레이트에 다시 시딩합니다.
  2. 48웰 플레이트를 약 20mL의 사전 오토클레이브 0.1% 젤라틴 용액으로 덮고 최소 1시간 동안 인큐베이터에 보관합니다. 약 500 μL의 준비된 0.1% 젤라틴을 48웰 플레이트에 피펫팅합니다. 젤라틴 플레이트를 인큐베이터에 10 분 동안 그대로 두십시오.
    알림: 이렇게 하면 젤라틴이 약간 부풀어 올라 표면을 덮고 수집된 스페로이드가 부착될 수 있는 더 나은 환경을 만들 수 있습니다.
  3. 피펫팅으로 스페로이드를 수집하고, 인큐베이터에서 수집된 스페로이드를 48웰 플레이트의 웰에 분배하고, 새로운 배지를 추가합니다. 그런 다음 12-24시간 동안 배양합니다.
    참고: 스페로이드를 세어 분배하는 것은 매우 어렵습니다. 단일 튜브에 스페로이드를 수집하고 전체 부피를 웰에 고르게 분배합니다. 이 연구를 위해 각 웰에는 약 4-6개의 스페로이드가 포함되어 있습니다.
    참고: 2D 샘플의 경우 사전 염색 세척으로 충분하며 매체 교체가 필요하지 않습니다.
  4. 배지를 제거하고 스페로이드가 맨 위에 오면 PBS로 세포를 천천히 세척합니다. 4 시간 동안 2 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.
  5. 샘플을 PBS로 다시 세척하고 약 10mL의 2% BSA 및 0.1% TritonX로 30분 동안 차단합니다. 그런 다음 PBS 3x로 세척하십시오.
  6. 선택된 프라이머 항체(N-cadherin-rabbit 및 β-III tubulin-mouse)를 항체 희석제 시약 용액으로 1:100 비율로 희석합니다. 각 샘플에 100μL의 항체 용액을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
  7. 샘플을 PBS로 3배 세척한다. β-III 튜불린에 대한 항-마우스 IgG-FTIC-토끼 및 N-Cad에 대한 항-마우스 IgG-SC2781-염소 2차 항체와 함께 실온에서 30분 동안 1:200으로 희석하여 배양합니다. 어둠 속에서 모든 작업을 수행하십시오.
    참고: 이중 염색에서 1차 항체(예: 마우스)로 사용되는 균주가 무엇이든 2차 항체에는 다른 균주(예: 염소 또는 토끼)를 사용해야 합니다.
  8. PBS 3x로 2차 항체를 세척한 다음 DAPI 용액(1:1)을 각 샘플에 떨어뜨립니다. 15-20분 동안 기다립니다. 면역형광 이미징을 수행합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그래핀 독성 및 2D 이미징
얻어진 MTT 결과의 통계분석은 통계분석 소프트웨어에서 Tukey's test를 이용한 one-way ANOVA로 진행하였으며, 얻어진 그래프는 도 2에 나타내었다. 대조군에 비해 그래핀 백분율은 0.001% 그래핀 농도에 대해서만 유의한 감소를 보였다(**p < 0.01). 다른 군과 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다(p > 0.05). 따라서 최적의 그래핀 농도는 0.1%로 측정되었는데, 이는 MTT 테스트 결과 및 스티칭 이미지에 따라 이 농도에 노출된 후 가장 높은 생존율이 관찰되었기 때문이다.

figure-results-1

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기존의 2D 방법에 비해 엔지니어링된 3D 스캐폴드로 적용된 처리의 이점은 날이 갈수록 두드러지고 있습니다. 이러한 치료법에 단독으로 사용되거나 생체 적합성 및 생분해성이 낮은 다양한 생체 재료로 생성된 스캐폴드와 함께 사용되는 줄기 세포는 일반적으로 말초 신경 재생에 부적절합니다. 와튼젤리 중간엽 줄기세포(WJ-MSCs)는 특히 획득 프로토콜의 최적화, 증식 능력 및 분화 능력을 고려할 때 적합한 후보 세포주인 것으로 보인다29. 이 연구에서 우리는 2D 및 3D 배양 모두에서 줄기 세포와 그래핀의 상호 작용을 조사했습니다. 또한 생성된 바이오하이브리드 하이드로겔 그룹의 신경성 분화를 2D 환경과 비교했습니다. 우리는 면역염색을 통해 바이오잉크의 신경구 형성을 입증했습니다. 추가 연구에서 우리는 SEM 및 FT/IR 방법으로 신경 채널로 주입 또는 이식할 수 있는 후보 프로토타입을 특성화했습니다. 이 연구는 생산된 생체 재료의 특성, 세포-생체 재료 상호 작용 및 생체 재료의 존재 하...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다. 이 프로젝트는 3D 바이오프린팅 기술 개발업체인 HD Bioink와 공동으로 수행되었습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에 사용된 그래핀은 커클라렐리대학교 기계공학과에서 개발되었다. Karabeyoğlu 박사가 기증했습니다. 그래핀 독성 시험은 TÜBİTAK 2209-B-산업 지향 학부 논문 지원 프로그램의 범위 내에서 완료된 "그래핀 도핑된 바이오잉크를 사용한 3D 바이오프린터에서 중간엽 줄기 세포의 인쇄 및 분화"(출원번호: 1139B411802273)라는 제목의 프로젝트에서 자금을 지원받았습니다. 연구의 다른 부분은 Yildiz Technical University Scientific Research Projects(TSA-2021-4713)에서 제공한 연구 기금의 지원을 받았습니다. 타임랩스 이미징 단계에서 사용된 GFP가 있는 중간엽 줄기 세포는 Virostem Biotechnology에서 기증했습니다. 저자는 생산적인 토론을 해준 Darıcı LAB과 YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB 팀에 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글

원심		분리기 Hitachi세포 배양 및 생체 재료에 사용 단계
0.1N CaCl2HD Bioink교차결합제
0.22 µ에 사용; m 멤브레인 필터Aι 에스&아이오타; mo살균에 사용
0.45 µ m 주사기 필터Aι 에스&아이오타; mo살균에 사용
1.5mL 원뿔 튜브Eppendorfa바이오 잉크 드롭에 사용
15mL 팔콘 튜브둥지세포 배양 단계에 사용
25cm2 세포 배양 플라스크 (Falcon, TPP 조직 배양 플라스크둥지세포 배양에 사용
3D 바이오 프린팅Axolotl Biosystems Bio A2 (터키)바이오프린팅 단계
50mL 팔콘 튜브둥지세포 배양 단계
6/24/48/96 웰 플레이트에 사용 (Falcon, TPP microplates)Merck Millipore세포 배양
단계 75 cm2 세포 배양 플라스크 (Falcon, TPP 조직 배양 플라스크둥지세포 배양에 사용
안티 마우스 IgG-FTIC-rabbitSanta Cruz BiotechnologyJ1514Seconder 항체, 염료
에 사용안티 마우스 IgG-SC2781-goatSanta Cruz BiotechnologyC3109Seconder 항체, 염료에 사용
Au 코팅 장치 EM ACE600LeicaSEM 이미징 전 생체 재료 섹션의 금 도금
AutoclaveNUVE-OT 90L살균 공정에 사용됩니다.
오토클레이브NUVE-OT 90L살균 공정에 사용됩니다.
Cell Cultre CabineHera Safe KS세포 배양 과정에 사용
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249세포 배양 배지로 사용
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450SEM
Fetal Bovine Serum-FBSCapricornFBS-16A용 세포 배양 배지에 첨가하여 사용하였다.
냉동고 -80° CPanasonicMDF-U5386S-PE세포와 그 결과로 생성된 엑소좀을 저장하는 데 사용되었습니다.
젤라틴-알긴산 바이오잉크 분말HD 바이오잉크된 바이오잉크 단계에 사용
GFP 표지-WJ-MSCsVirostem세포-바이오잉크 상호 작용
그래핀 나노혈소판(Graphene-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.생산에 사용 3D-G 바이오 잉크
면역 형광 항체 (N-CAD; β -III Tubulin)세포 신호 및 산타 크루즈염료
JASCO 6600Tetrafor FTIR
MTT 분석시그마생존력 테스트
Penicilin / Streptomycin 용액CapricornPB-S오염을 방지하기 위해 배지에 첨가되었습니다. 세포 배양에서.
Thoma slideIsolab세포 계수에 사용
타임랩스 이미징 시스템Zeiss Axio.Observer.Z1Imaging
Tripsin-EDTAMulticell플라스크는 표면을 덮고 있는 세포를 제거하는 데 사용되었습니다.
VorteksBiobase생산 된 바이오 잉크 단계
WJ-MSCsATCC세포 배양 공정에 사용됩니다.
생산에 대한 이미징에 사용는

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
  3. Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195(2021).
  4. Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
  5. Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
  6. Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
  7. Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
  8. Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
  9. Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
  10. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  11. Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743(2021).
  12. Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
  13. Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
  14. Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
  15. Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
  16. Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
  17. Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
  18. Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
  19. Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
  20. Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448(2017).
  21. Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
  22. Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
  23. Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
  24. Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
  25. Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658(2019).
  26. Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
  27. Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789(2013).
  28. Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
  29. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
  30. Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
  31. Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
  32. Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
  33. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

3D

관련 논문