우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
마이크로패턴 견인 현미경 검사는 단일 세포 및 세포 클러스터의 모양을 제어할 수 있게 해줍니다. 또한, 마이크로미터 길이 스케일로 패턴화하는 능력은 각 마이크로패턴화된 도트가 부드럽고 근본적인 하이드로겔을 변형시키는 단일 초점 접착의 형성을 허용하기 때문에 견인력의 측정을 위해 이러한 패턴화된 접촉 구역의 사용을 허용한다. 이러한 접근법은 내피 세포, 평활근 세포, 섬유아세포, 혈소판 및 상피 세포를 포함하는 광범위한 세포 유형에 사용되어 왔다.
이 리뷰는 미리 지정된 크기와 간격의 점들의 규칙적인 배열에서 폴리아크릴아미드 하이드로젤 상에 세포외 매트릭스 단백질을 인쇄할 수 있게 하는 기술의 진화를 설명한다. 마이크로 미터 크기의 패턴은 부드러운 기판에 직접 인쇄하기가 어렵 기 때문에 단단한 유리 커버 슬립에서 패턴이 먼저 생성 된 다음 겔화 중에 패턴을 하이드로 겔로 전달하는 데 사용됩니다. 먼저, 커버슬립 상에 작은 점들의 어레이를 생성하기 위한 원래의 마이크로컨택트 인쇄 접근법이 설명된다. 작은 점의 섬을 떠나기 위해 대부분의 패턴을 제거하는 두 번째 단계는 패턴화 된 점의 배열에서 셀과 셀 클러스터의 모양을 제어해야합니다.
다음으로, 단일 감산 패터닝 단계를 사용하여 점들의 섬들을 생성할 수 있게 하는 이러한 접근법의 진화가 설명된다. 이 접근법은 사용자를 위해 크게 단순화되었지만 패턴을 만드는 데 필요한 마스터 몰드의 수명이 감소하는 단점이 있습니다. 마지막으로, 변위된 점들의 이미지 분석과 후속 세포 생성 견인 필드의 분석을 위해 개발된 계산 접근법이 설명되고, 이러한 분석 패키지의 업데이트된 버전이 제공된다.
서론
대부분의 세포 표현형은 환경에 견인력을 발휘합니다. 이러한 견인력은 액틴과 미오신의 네트워크인 세포의 수축성 세포골격, 그리고 다른 필라멘트성 바이오폴리머 및 가교결합 단백질1,2,3,4에 의해 생성된다. 세포 내에서 생성된 힘은 주로 인테그린 및 카데린과 같은 막횡단 단백질을 통해 세포외 환경 또는 인접한 세포로 전달될 수 있으며, 각각 5,6. 세포가 어떻게 퍼지거나 수축하는지, 그리고 그 움직임과 관련된 견인력의 크기는 환경과의 친밀한 대화의 결과이며, 이는 주로 세포외 기질 (ECM)7,8에 존재하는 단백질의 유형과 양 및 ECM의 강성에 달려 있습니다. 실제로, 견인력 현미경 검사는 기질 강성, 부과 된 기계적 스트레스 및 균주 또는 다른 세포와의 접촉과 같은 국소 자극에 대한 세포 반응성을 이해하는 데 귀중한 도구가되었습니다. 이 정보는 암 및 ....
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프로토콜
1. 실리콘 마스터의 창조
참고: PDMS 스탬프의 반복 성형을 위한 실리콘 마스터의 설계, 생성 및 문제 해결 프로세스의 대부분은 이전에21에서 다루었으므로이 새로운 접근 방식의 주요 차이점 만 여기에 설명되어 있습니다.
- AutoCAD 또는 유사한 설계 소프트웨어를 사용하여 포토마스크에 대한 설계를 작성합니다. 얇은 유리 조각인 포토마스크의 한쪽면을 크롬의 얇은 층으로 코팅하여 UV 광 산란을 제어합니다. 포토마스크를 디자인하여 선택한 포토레지스트에 자외선을 비추면 최종 PDMS 스탬프에서 원하는 피쳐의 역으로 실리콘 마스터가 생성되도록 합니다. 이 마스크의 디자인에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
참고: 원하는 피처 또는 외부 영역을 포토마스크에서 투명하게 만들어야 하는지 여부는 선택한 포토레지스트에 따라 다릅니다. 여기에 사용 된 포토레지스트는 SU-8 2005 (주의 : 가연성, 피부 및 눈 자극성, 열 / 화염 / 불꽃을 피하고 취급시 보호 장갑 및 안경 사용)입니다.- 네거티브 포토레지스트를 자외선에 노출시키고 경화되지 않은 SU-8을 화학 용매로 제거하여 치료하십시오....
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결과
E = 3.6 kPa의 영 모듈러스와 ν = 0.445의 푸아송 비율을 갖는 PAA 하이드로젤은 이러한 감산 마이크로패터닝 방법에 의해 사용하기 위해 제조되었다. 하이드로젤은 두께가 ~100μm로 제작되어 여기에 사용된 이미징 설정으로 이미징할 수 있으며 셀이 젤 아래의 단단한 커버슬립을 감지하는 것을 방지하여 세포 강성 감지23,33에 초점을 맞춘 연구에서 문제를 일으킬 수 있습니다. 다른 많은 강성 수준(최대 30kPa)의 겔은 간접 마이크로패터닝 방법(34)을 사용하여 성공적으로 제조되고 이미징되었으므로, 이 방법은 단지 3.6 kPa 하이드로젤의 사용에만 국한되지 않는다. 커버슬립은 글루타르알데히드로 미리 처리되어 상단 패턴화된 커버슬립을 제거할 때 젤이 하부 커버슬립에 고정된 상태로 유지되도록 합니다(그림.......
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토론
PAA 하이드로젤을 간접적으로 패터닝하는 개선된 방법이 본 논문에 기재되어 있다. 이 접근법은 20,35,36,37,38,39,40,41,42 이전에 사용 된 메소드를 기반으로합니다. 주요 변화는 PDMS 스탬프가 이제 단백질을 제거하고 패턴을 직접 스탬핑하는 대신 중간 기질에 원하는 패턴을 남겨 두는 데 사용된다는 것입니다. 이를 통해 고충실도 마이크로 패턴을 훨씬 더 일관되게 만들고 이전에는.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 데이터 분석에 대한 유용한 토론과 도움을 주신 Boston University Department of Mechanical Engineering의 Paul Barbone 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NSF 보조금 CMMI-1910401에 의해 지원되었습니다.
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재료
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| 15 mL 원추형 튜브 | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | 맞춤형 마스크 |
| 6 웰 플레이트 | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| 아세톤 | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| 아크릴아미드 용액, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| 과황산 아미노늄 | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| 비사크릴아미드 | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| 에탄올 | 그린필드 글로벌 | #111000200C1GL | |
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| UV 홍수 노출 | Newport | #69910 | |
| 웨이퍼 캐리어 트레이, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #의 19395-40 |
참고문헌
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L.
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