방법 논문

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

DOI:

10.3791/63628

⸱

2022년 2월 17일

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

이 논문에서

요약

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우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

초록

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마이크로패턴 견인 현미경 검사는 단일 세포 및 세포 클러스터의 모양을 제어할 수 있게 해줍니다. 또한, 마이크로미터 길이 스케일로 패턴화하는 능력은 각 마이크로패턴화된 도트가 부드럽고 근본적인 하이드로겔을 변형시키는 단일 초점 접착의 형성을 허용하기 때문에 견인력의 측정을 위해 이러한 패턴화된 접촉 구역의 사용을 허용한다. 이러한 접근법은 내피 세포, 평활근 세포, 섬유아세포, 혈소판 및 상피 세포를 포함하는 광범위한 세포 유형에 사용되어 왔다.

이 리뷰는 미리 지정된 크기와 간격의 점들의 규칙적인 배열에서 폴리아크릴아미드 하이드로젤 상에 세포외 매트릭스 단백질을 인쇄할 수 있게 하는 기술의 진화를 설명한다. 마이크로 미터 크기의 패턴은 부드러운 기판에 직접 인쇄하기가 어렵 기 때문에 단단한 유리 커버 슬립에서 패턴이 먼저 생성 된 다음 겔화 중에 패턴을 하이드로 겔로 전달하는 데 사용됩니다. 먼저, 커버슬립 상에 작은 점들의 어레이를 생성하기 위한 원래의 마이크로컨택트 인쇄 접근법이 설명된다. 작은 점의 섬을 떠나기 위해 대부분의 패턴을 제거하는 두 번째 단계는 패턴화 된 점의 배열에서 셀과 셀 클러스터의 모양을 제어해야합니다.

다음으로, 단일 감산 패터닝 단계를 사용하여 점들의 섬들을 생성할 수 있게 하는 이러한 접근법의 진화가 설명된다. 이 접근법은 사용자를 위해 크게 단순화되었지만 패턴을 만드는 데 필요한 마스터 몰드의 수명이 감소하는 단점이 있습니다. 마지막으로, 변위된 점들의 이미지 분석과 후속 세포 생성 견인 필드의 분석을 위해 개발된 계산 접근법이 설명되고, 이러한 분석 패키지의 업데이트된 버전이 제공된다.

서론

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대부분의 세포 표현형은 환경에 견인력을 발휘합니다. 이러한 견인력은 액틴과 미오신의 네트워크인 세포의 수축성 세포골격, 그리고 다른 필라멘트성 바이오폴리머 및 가교결합 단백질1,2,3,4에 의해 생성된다. 세포 내에서 생성된 힘은 주로 인테그린 및 카데린과 같은 막횡단 단백질을 통해 세포외 환경 또는 인접한 세포로 전달될 수 있으며, 각각 5,6. 세포가 어떻게 퍼지거나 수축하는지, 그리고 그 움직임과 관련된 견인력의 크기는 환경과의 친밀한 대화의 결과이며, 이는 주로 세포외 기질 (ECM)7,8에 존재하는 단백질의 유형과 양 및 ECM의 강성에 달려 있습니다. 실제로, 견인력 현미경 검사는 기질 강성, 부과 된 기계적 스트레스 및 균주 또는 다른 세포와의 접촉과 같은 국소 자극에 대한 세포 반응성을 이해하는 데 귀중한 도구가되었습니다. 이 정보는 암 및 ....

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프로토콜

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1. 실리콘 마스터의 창조

참고: PDMS 스탬프의 반복 성형을 위한 실리콘 마스터의 설계, 생성 및 문제 해결 프로세스의 대부분은 이전에21에서 다루었으므로이 새로운 접근 방식의 주요 차이점 만 여기에 설명되어 있습니다.

  1. AutoCAD 또는 유사한 설계 소프트웨어를 사용하여 포토마스크에 대한 설계를 작성합니다. 얇은 유리 조각인 포토마스크의 한쪽면을 크롬의 얇은 층으로 코팅하여 UV 광 산란을 제어합니다. 포토마스크를 디자인하여 선택한 포토레지스트에 자외선을 비추면 최종 PDMS 스탬프에서 원하는 피쳐의 역으로 실리콘 마스터가 생성되도록 합니다. 이 마스크의 디자인에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
    참고: 원하는 피처 또는 외부 영역을 포토마스크에서 투명하게 만들어야 하는지 여부는 선택한 포토레지스트에 따라 다릅니다. 여기에 사용 된 포토레지스트는 SU-8 2005 (주의 : 가연성, 피부 및 눈 자극성, 열 / 화염 / 불꽃을 피하고 취급시 보호 장갑 및 안경 사용)입니다.
    1. 네거티브 포토레지스트를 자외선에 노출시키고 경화되지 않은 SU-8을 화학 용매로 제거하여 치료하십시오....

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결과

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E = 3.6 kPa의 영 모듈러스와 ν = 0.445의 푸아송 비율을 갖는 PAA 하이드로젤은 이러한 감산 마이크로패터닝 방법에 의해 사용하기 위해 제조되었다. 하이드로젤은 두께가 ~100μm로 제작되어 여기에 사용된 이미징 설정으로 이미징할 수 있으며 셀이 젤 아래의 단단한 커버슬립을 감지하는 것을 방지하여 세포 강성 감지23,33에 초점을 맞춘 연구에서 문제를 일으킬 수 있습니다. 다른 많은 강성 수준(최대 30kPa)의 겔은 간접 마이크로패터닝 방법(34)을 사용하여 성공적으로 제조되고 이미징되었으므로, 이 방법은 단지 3.6 kPa 하이드로젤의 사용에만 국한되지 않는다. 커버슬립은 글루타르알데히드로 미리 처리되어 상단 패턴화된 커버슬립을 제거할 때 젤이 하부 커버슬립에 고정된 상태로 유지되도록 합니다(그림.......

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토론

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PAA 하이드로젤을 간접적으로 패터닝하는 개선된 방법이 본 논문에 기재되어 있다. 이 접근법은 20,35,36,37,38,39,40,41,42 이전에 사용 된 메소드를 기반으로합니다. 주요 변화는 PDMS 스탬프가 이제 단백질을 제거하고 패턴을 직접 스탬핑하는 대신 중간 기질에 원하는 패턴을 남겨 두는 데 사용된다는 것입니다. 이를 통해 고충실도 마이크로 패턴을 훨씬 더 일관되게 만들고 이전에는.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 데이터 분석에 대한 유용한 토론과 도움을 주신 Boston University Department of Mechanical Engineering의 Paul Barbone 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NSF 보조금 CMMI-1910401에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(3-아미노프로필)트리메톡시실란Sigma Aldrich#281778
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific#05-408-129
15 mL 원추형 튜브Fisher Scientific#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome PhotomaskAdvance Reproductions CorporationN/A맞춤형 마스크
6 웰 플레이트Fisher Scientific#07-200-83
아세톤Fisher Scientific#A18P-4
아크릴아미드 용액, 40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
과황산 아미노늄Fisher Scientific#BP179-25
비사크릴아미드Fisher Scientific#PR-V3141
에탄올그린필드 글로벌#111000200C1GL
유리 커버슬립, 25mm 라운드Fisher Scientifc#12-545-102
유리 커버슬립, 30mm 라운드워너#64-1499
하마마츠 ORCA-R2 카메라하마마츠#C10600-10B
인간 플라즈마밸리 생물의학#HP1051P분리에 사용 피브로넥틴
염산, 1.0 N밀리포어 시그마#1.09057
이미지J웨인 래스밴드#1.53n
교체 가능한 커버슬립 접시 세트Bioptechs#190310-35
Kim WipesFisher Scientific#06-666-11C
마스크 AlingerKarl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph BasicMolecular Devices#v7.7.1.0
N-하이드록시숙신이미드 에스테르Sigma Aldrich#130672-5G
NucBlue Live Cell StainThermo Fisher#R37605
Olympus IX2-ZDC 도립 현미경Olympus#IX81
PD-10 탈염 컬럼GE Healthcare#52-1308-00
포토레지스트 스피너 후드Headway Research#PWM32
플라즈마 세정기Harrick#PDC-001
플라즈마 에칭기TePla#M4L
Prior Lumen 200Pro 광원Prior Scientific#L200
실리콘 웨이퍼, 100mmUniversity Wafer#809
SU-8 2005Kayaku 고급 재료 Inc.
SU-8 개발자Kayaku Advanced Materials Inc.
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머Essex Brownell#DC-184-1.1
테트라메틸에틸렌디아민Fisher Scientific#BP150-20
트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란시그마 알드리치#448931
UAPON-40XW340 대물렌즈올림푸스#N2709300
UV 홍수 노출Newport#69910
웨이퍼 캐리어 트레이, 110 x 11 mmTed Pella, Inc.#의 19395-40
#NC9463827#NC9901158

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L.

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