Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

요약

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

초록

유전 된 면역은 일부 동물이 이전 감염의 "기억"을 자손에게 전달할 수있는 방법을 설명합니다. 이것은 자손의 병원균 내성을 높이고 생존을 촉진 할 수 있습니다. 유전 된 면역은 많은 무척추 동물에서보고되었지만,이 후성 유전 적 현상의 기초가되는 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 천연 microsporidian 병원균 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 microsporidia에 강력하게 저항하는 자손을 생산하는 웜을 초래합니다. 본 프로토콜은 단순하고 유전적으로 다루기 쉬운 N. parisii-C. elegans 감염 모델에서 세대 간 면역의 연구를 기술한다. 현재 기사는 C. elegans를 감염시키고 면역 프라이밍 된 자손을 생성하는 방법을 설명합니다. 현미경 검사에 대한 염색 및 현미경 검사에 의한 감염을 시각화하여 microsporidia 감염에 대한 내성을 분석하는 방법도 제공됩니다. 특히, 유전 된 면역은 미세 스포리디아에 의한 숙주 세포 침윤을 방지하고, 계내 혼성화 (FISH)에서의 형광은 침윤 사건을 정량화하는데 사용될 수 있다. 면역-프라이밍된 자손에서 생성된 미세 포자의 상대적 양은 포자를 키틴-결합 염료로 염색함으로써 정량화될 수 있다. 지금까지 이러한 방법은 유전 된 면역의 동역학 및 병원체 특이성뿐만 아니라 그 기초가되는 분자 메커니즘에 대해 밝혀 왔습니다. 이러한 기술은 C. elegans 연구에 사용할 수있는 광범위한 도구와 함께 유전 된 면역 분야에서 중요한 발견을 가능하게합니다.

서론

유전 된 면역은 병원균에 대한 부모의 노출로 감염 저항성 자손의 생산을 가능하게하는 후성 유전 적 현상입니다. 이러한 유형의 면역 기억은 적응 면역 체계가 부족하고 바이러스, 박테리아 및 곰팡이 질환으로부터 보호 할 수있는 많은 무척추 동물에서 나타났습니다¹. 유전 된 면역은 건강과 진화를 이해하는 데 중요한 영향을 미치지 만,이 보호의 기초가되는 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 이것은 부분적으로 유전 된 면역이 묘사 된 많은 동물들이 연구를위한 모델 유기체가 확립되지 않았기 때문입니다. 대조적으로, 투명한 선충류 Caenorhabditis elegans에 대한 연구는 광범위한 유전 및 생화학 적 툴킷 ^2,3, 고도로 주석이 달린 게놈 ^4,5 및 짧은 생성 시간의 이점을 얻습니다. 실제로 C. elegans의 연구는 후성 유전학 및 선천적 면역 ^6,7 분야에서 근본적인 발전을 가능하게했으며, 이제는 면역 기억

프로토콜

본 연구는 21°C에서 성장한 야생형 C. 엘레간스 브리스톨 균주 N2를 사용한다.

1. 미디어의 제조

1. 이전 보고서^21,22에 따라 M9 미디어를 준비^합니다.
2. 이전 보고서^21,22에 따라 선충류 성장 배지 (NGM)를 준비^하십시오. 6cm 플레이트당 NGM 12mL를 붓거나 플레이트 10cm당 30mL를 붓습니다.
3. 이전 보고서²³에 따라 대장균 OP50-1 균주를 준비한다.
4. 아래 단계에 따라 OP50-1-시딩된 NGM 플레이트를 준비한다.
   1. 볼텍싱으로 10x 농축 OP50-1을 재현탁합니다.
   2. 리피터 피펫을 사용하여 중앙에 플레이트를 시드하십시오. 6 cm 및 10 cm 플레이트의 경우, 각각 200 μL 또는 500 μL의 부피를 갖는 시드.
   3. 10cm 플레이트의 경우 유리 스프레더를 사용하여 OP50-1을 퍼뜨....

결과

본 연구에서, C. elegans (P0)의 부모 집단은 L1 단계에서 낮은 용량의 N. parisii 포자로 감염되었다. 이러한 감염 조건은 일반적으로 부모의 표백을 통해 많은 수의 미세 스포리디아 내성 F1 자손을 얻는 데 사용됩니다. 감염된 부모 집단 및 감염되지 않은 대조군을 72 hpi로 고정시키고, DY96으로 염색하여 웜 배아 및 미세스포리디아 포자를 시각화하였다(도 1A). 감염된 동물은 작고, 많은 미세 스포자를 함유하고, 건강한 감염되지 않은 대조군보다 적은 배아를 생산합니다. 웜 중량의 평가는 감염되지 않은 동물의 ~ 95 %가 감염된 동물의 80 % 미만에 비해 자손을 생산한다는 것을 보여주었습니다 (그림 1B). 정량화에 따르면 DY96 염색된 포자를 함유하는 웜의 수에 의해 결정된 바와 같이, 미세 스포리디아 처리 집단의 ~90%가 감염되었다는 것을 밝혀냈다(

토론

본 프로토콜은 단순하고 유전적으로 다루기 쉬운 N. parisii-C. elegans 감염 모델에서 microsporidia 및 유전 된 면역의 연구를 설명합니다.

포자 준비는 생산성²⁴에 따라 일반적으로 6 개월의 실험 동안 충분한 포자를 산출하는 집중적 인 프로토콜입니다. 중요하게도, 감염성은 실험에 사용하기 전에 각각의 새로운 포자 "제비"에 대해 결정되어야 한다. 포자 제제 사이의 감염성의 가변성으로 인해, 단일 로트는 실험의 모든 반복에 대해 일관되게 사용되어야 한다. 해동하면 포자가 발사되고 감염성이 감소 할 수 있으므로 개별 분취량을 해동하거나 다시 얼려서는 안됩니다. 따라서 포자는 감염 직전에 -80 °C 냉동고에서만 제거되어야하며 벤치에있는 동안 얼음 위에 유지되어야합니다.

단계 5-6에서, 감염 분석이 윤곽을 드러냈다. 감염 분석 중에는 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2.0mm 지르코니아 구슬	Biospec Products Inc.	11079124ZX
10 mL 주사기	Fisher Scientific	1482613
5 μ m 필터	Millipore Sigma	SLSV025LS
Axio Imager 2	현미경 슬라이드의 DY96 및 FISH 염색 벌레 이미징을 위한	Zeiss	-
Axio Zoom V.16 형광 스테레오 줌 현미경	Zeiss-IPR	을 시각화하기 위한 형광 형질전환 동물의 실시간 이미징용
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean	Bench Baker	-
비드 디스럽터, 지니 SI-D238 아날로그 디스럽터 지니 세포 디스럽터, 120V	글로벌 산업용	T9FB893150
셀-VU 슬라이드, 밀레니엄 사이언스 일회용 정자 수 세포분석기	Fisher Scientific	DRM600
다이렉트 옐로우 96	시그마-알드리치	S472409-1G
EverBrite 마운팅 미디어(DAPI	비오튬	23001
포함)DAPI	Biotium	23002
Fiji/ImageJ 소프트웨어가	ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads
기계식 로터	Thermo Sceintific	415110 / 1834090806873	를 위해 표백된 배아의 튜브를 회전시키는 데 사용됩니다
	.	-	Quasar 570 (Cy3) 5' 변형 및 HPLC 정제, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2	Wild-type, Bristol strain	Default strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-100G
수산화나트륨 용액 (5 N)	Fisher Chemical	FLSS256500
차아염소산나트륨 용액 (6% )	피셔 케미컬	SS290-1
Stemi 508 스테레오 현미경	Zeiss	-	웜의 일일 유지 보수 및 분석 설정을 위한 L1 웜 계수
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
Vectashield + A16	Biolynx	VECTH1500

형광 현미경 없는 EverBrite 장착 매체 하룻밤 부화 MicroB FISH 프로브 Biosearch Technologies Inc.