여기에서는 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 Bursaphelenchus xylophilus 에서 RNA 간섭에 대한 상세한 담그는 방법을 소개합니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
소나무 선충류 인 Bursaphelenchus xylophilus는 전 세계적으로 가장 파괴적인 침입 종 중 하나이며 소나무의 시들음과 결국 죽음을 초래합니다. 그들의 경제적 및 환경적 중요성에 대한 인식에도 불구하고, 지금까지 기존의 전방 유전학 및 트랜스제닉 방법을 사용하여 식물 기생 선충류 (PPNs)의 상세한 유전자 기능을 연구하는 것은 불가능했습니다. 그러나, 역 유전학 기술로서, RNA 간섭 (RNAi)은 B. xylophilus 를 포함한 선충류의 기능적 유전자에 대한 연구를 용이하게합니다.
이 논문은 B. xylophilus에서 ppm-1 유전자의 RNAi에 대한 새로운 프로토콜을 간략하게 설명하며, 이는 다른 병원성 선충류의 개발 및 재생에 중요한 역할을하는 것으로 보고되었습니다. RNAi의 경우, T7 프로모터를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 표적 단편의 5'-말단에 연결시키고, 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 이어서, dsRNA 전달은 선충류를 합성 신경자극제와 혼합된 dsRNA 용액에 담그면서 달성되었다. B. xylophilus (대략 20,000 개체)의 동기화된 청소년을 세척하고 25°C에서 어둠 속에서 24 h 동안 담금질 완충액 중의 dsRNA (0.8 μg/mL)에 담갔다.
동일한 양의 선충류를 대조군으로서 dsRNA가 없는 침지 완충액에 넣었다. 한편, 또 다른 동일한 양의 선충류를 대조군으로서 녹색 형광 단백질(gfp) 유전자 dsRNA와 함께 침지 완충액에 넣었다. 침지 후, 표적 전사체의 발현 수준은 실시간 정량적 PCR을 사용하여 결정하였다. RNAi의 효과는 표현형의 현미경 관찰과 그룹 간의 성인의 신체 크기 비교를 사용하여 확인되었습니다. 현재의 프로토콜은 B. xylophilus 및 기타 기생 선충류의 유전자 기능을 유전 공학을 통해 통제 전략을 개발하기위한 연구를 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
서론
식물 기생 선충류 (PPN)는 식량 안보 및 산림 생태계에 대한 지속적인 위협입니다. 그들은매년 1,000 억 달러의 경제적 손실을 초래하며, 그 중 가장 문제가되는 것은 주로 뿌리 매듭 선충류, 낭종 선충류 및 소나무 선충류입니다. 파인우드 선충류인 Bursaphelenchus xylophilus는 소나무 시들음병의 원인균인 이주, 내구생 선충류입니다2. 그것은 전 세계적으로 소나무 숲에 큰 해를 끼쳤습니다3. Van Megen et al.4의 용어를 사용하여, B. xylophilus 는 Parasitaphelenchidae의 구성원이며 clade 10에 속하는 반면, 대부분의 다른 주요 식물 기생충은 clade 12에 속합니다.
독립적이고 최근에 진화 된 식물 기생충 인 B. xylophilus 는 비교 연구를위한 매력적인 모델입니다. 현재까지 clade 12에 속하는 뿌리 매듭 선충류와 낭종 선충류에 대한 상당한 연구가 있었으며, 이는 의무적이며 앉아있는 내생 기생충이며 가장 강렬하게 연구 된 선충류 중 일부입니다. 그....
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프로토콜
이 연구는 절강 농업 및 임업 대학의 동물 실험위원회에서 승인했습니다. B. xylophilus 분리 NXY61은 원래 중국 절강 성 닝보 (Zhejiang)11의 닝보 (Ningbo) 지역의 병든 Pinus massoniana에서 추출되었습니다.
1. 유전자 클로닝
참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머에 대한 자세한 내용은 자료표를 참조하십시오.
- 선충류를 수집하십시오.
- Botrytis cinerea의 균사체 상의 B. xylophilus 균주를 감자 덱스트로스 한천 (PDA) 플레이트 상에서 3-5일 동안 25°C에서 배양하였다.
- Bellman 깔때기 방법14를 사용하여 선충류를 수집하십시오.
- 클램핑된 고무 튜브를 깔때기 아래에 놓고 깔때기 입에 여과지 두 겹을 놓습니다. 곰팡이 배양물을 깔때기로 옮기고 물을 추가하여 곰팡이 매트를 담그십시오. 2 시간 동안 기다린 다음 선충류를 수집하십시오.
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결과
RNAi 후 B. xylophilus 의 ppm-1 발현 분석
GFP dsRNA와 표적 유전자 dsRNA로 침지시킨 B. xylophilus의 ppm-1 유전자의 상대적 발현량은 각각 0.92 및 0.52이었다(ddH2O 처리 대조군의 ppm-1 유전자 발현량은 1로 설정하였다)(도 1). 따라서, 외인성 dsRNA는 B. 크실로필루스의 ppm-1 발현에 아무런 영향을 미치지 않으며; 그러나, ppm-1 dsRNA는 표적 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다.
ppm-1 .......
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토론
B. xylophilus의 삶의 역사와 기생 환경은 다른 선충류의 삶과 다르지만,이 식물 병원균의 분자 병인에 대한 연구는 제한적이었습니다. C. elegans 및 기타 선충류에 CRISPR / Cas9 게놈 편집 기술을 적용하는 데 큰 진전이 있었음에도 불구하고 B. xylophilus에 적용된 RNAi 기술 만현재까지 17 일까지 발표되었습니다. RNAi는 선충류의 유전자 기능을 연구하는 데 사용할 수있는 가장 강력한 도구 중 하나이며 B. xylophilus 유전자 기능, 신호 전달 경로 및 유전자 치료18,19,20을 밝히는 연구에 널리 사용되었습니다. 무척추동물 모델에 사용되는 유전자 녹아웃 접근법과는 달리, 선충류에서 표적 유전자의 RNAi 매개.......
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공개 사항
이해 상충은 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31870637, 31200487)이 자금을 지원했으며 절강 핵심 연구 계획 (2019C02024, LGN22C160004)이 공동으로 자금을 지원했습니다.
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| <엠>Bursaphelenchus 실로필루스 | 해당 없음 | 해당 없음 | 이 나무의 번호는 NXY61이며, 원래 중국 저장성 닝보의 병균 Pinus massoniana에서 채취되었습니다. |
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참고문헌
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. <....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus
Posted by JoVE Editors on 4/16/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/63645-v
