Method Article

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 개선된 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하여 단백질 인산화를 정량화하기 위한 샘플 준비 및 데이터 분석을 기술한다.

Abstract

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인산화는 단백질 기능을 조절하고 세포 신호 전달 결과를 지시하는 필요한 번역 후 변형입니다. 단백질 인산화를 측정하는 현재의 방법은 개별 단백질에 걸친 인산화에서 이질성을 보존할 수 없다. 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석은 유리 커버슬립 상의 단백질의 면역침전을 통해 거대분자 복합체의 조성을 조사하기 위해 개발되었으며, 이어서 단일 분자 이미징이 뒤따랐다. 현재의 기술은 단일 분자 수준에서 전장 막 수용체의 인산화 상태의 강력한 정량화를 제공하는 SiMPull의 적응입니다. 이러한 방식으로 수천 개의 개별 수용체를 이미징하면 단백질 인산화 패턴을 정량화 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 샘플 준비에서 이미징에 이르기까지 최적화된 SiMPull 절차를 자세히 설명합니다. 유리 제제 및 항체 고정 프로토콜의 최적화는 데이터 품질을 더욱 향상시킵니다. 현재 프로토콜은 샘플 내에서 인산화된 수용체의 분획을 계산하는 단일 분자 데이터 분석을 위한 코드를 제공합니다. 이 연구는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 인산화에 초점을 맞추는 반면, 프로토콜은 다른 막 수용체 및 세포질 신호 분자로 일반화 될 수 있습니다.

Introduction

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막-관련 신호전달은 리간드-유도된 막 수용체 활성화 및 신호를 전파하는 하류 부속 단백질의 모집의 조합에 의해 조정된다. 수용체 세포질 꼬리에서 주요 티로신의 인산화는 신호전달 복합체 또는 신호전달복합체 1,2의 형성을 개시하는데 매우 중요하다. 따라서 생물학에서 중요한 질문은 신호 전달 파트너를 모집하고 세포 결과를 지시하기 위해 인산화 패턴을 만들고 유지하는 방법입니다. 이는 시그널 로솜 3,4,5,6,7의 조성을 지시함으로써 신호전달 출력을 조작하는 수단을 제공할 수 있는 풍부하고 특정한 포스포티로신 패턴 모두에서 수용체 인산화의 이질성을 이해하는 것을 포함한다. 그러나, 단백질 인산화를 심문하는 현재의 방법에는 한계가 있다. 웨스턴 블롯 분석은 단백질 인산화의 경향을 설명하는 데 탁월하지만 반 정량적8이며 수천 ~ 수백만 개의 수용체가 함께 평균화....

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Protocol

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1. 커버슬립 준비

참고 :이 단계에서는 니트릴 장갑, 안전 안경 또는 안면 보호막의 이중 레이어와 실험실 코트가 포함 된 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다.

  1. 피라냐 에칭을 수행하여 유리에서 유기 파편을 제거하십시오.
    주의: 피라냐 용액은 강한 산화제로서 유기물과 접촉할 때 부식성이 강하고 반응성이 높습니다. 유기 파편과의 반응은 발열성이며 폭발 가능성이 있습니다. 따라서 절차는 새시를 낮추는 화학 흄 후드에서 수행되어야합니다. Pyrex 유리 제품은 피라냐 솔루션을 처리하는 데 필요합니다.
    1. 화학 흄 후드 안에 작업 공간을 준비하십시오. 커버슬립을 4L 유리 비이커인 "반응" 비이커의 바닥에 겹치지 않고 배열하고, 반응 비커를 부드러운 열로 핫플레이트 위에 놓습니다. 유리 제품을 10 분 동안 따뜻하게하십시오. "폐기물" 1 L 유리 비이커를 500 mL의ddH2O근위 반응 비이커에 놓는다.
    2. 49 mL의 12 N 황산 (H2SO4)을 유리 혈청학적 피펫으로 반응 비이커에 천천히 첨가한다. 폐기하기 전에 폐기물 비이커에서 피펫을 헹구십시오.
    3. 21 mL의 30% 과산화수소(....

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Results

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SiMPull 프로세스를 묘사하는 만화가 그림 1A에 나와 있습니다. 커버슬립은 비오티닐화 항-EGFR 항체의 앵커로서 NeutrAvidin을 사용하여 총 단백질 용해물로부터 EGFR-GFP를 포획하여 기능화된다. 결합되지 않은 단백질을 세척한 후, 인산화된 수용체는 항-포스포티로신(anti-PY) 항체15로 표지된다. 도 1B 는 소수성 어레이의 이미지를 보여주며, 여기서 다수의 샘플이 동일한 커버슬립 상에서 제조되고 이미지화될 수 있다. 이 샘플 홀더의 한 가지 장점은 ~10μL의 최소 샘플 부피가 필요하다는 것입니다. 커버 슬립은 현미경 스테이지에 직접 배치하여 이미징 할 수 있습니다. 그러나 커버슬립 홀더를 사용하여 커버슬립을 안정화하는 것이 도움이 됩니다. 그림 1B 에 표시된 커버슬립 홀더는 3D 프린터를 사용하여 만.......

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Discussion

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여기에 기술된 프로토콜은 단일 단백질 수준에서 수용체 인산화의 정량적 측정을 가능하게 하도록 최적화되었다. SiMPull 프로토콜에 대한 몇 가지 간단하지만 중요한 변형이 개발되어 NaBH4 처리로 자가 형광을 감소시키고 항체 해리를 방지하기 위해 샘플의 후고정을 포함하여 포스포티 로신 검출을 위한 측정의 신뢰성을 향상시켰다. 녹색 채널 마스크를 사용하여 항-PY 항체와의 공국소화의 계산을 위한 수용체 위치를 확인함으로써 또한 세포 용해물에 대한 항체의 비특이적 결합으로부터 잠재적인 아티팩트를 제거함으로써 측정 정확도를 향상시킨다. 두 가지 컬러 이미징은 인산화된 수용체의 분획을 검출하기 위해 이용되었다. 이 시나리오에서, 수용체는 GFP로 유전적으로 태그되었고, 항체는 원거리 적색 염료로 직접 표지되었다. SiMPull 접근법은 세포 내 단백질을 포함하여 특정 항체를 사용할 수있는 다른 단백질 표적에 적용됩니다. 또한, 변성 조건이 필요하지 않기 때문에, 다중 서브유닛 수용체/복합체도 포획될 수 있다. 그러.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 국립 보건원 R35GM126934, R01AI153617 및 R01CA248166에서 DSL로 지원했습니다. EMB는 ASERT-IRACDA 프로그램(NIH K12GM088021)과 UNM MARC 프로그램(NIH 2T34GM008751-20)에 의해 JAR을 통해 지원되었다. 우리는 NIH P30CA118100이 지원하는 뉴 멕시코 대학 종합 암 센터 형광 현미경 공유 자원을 사용하여 감사하게 인정합니다. 우리는 SiMPull의 원래 개발이이 작품에 영감을 준 Ankur Jain 박사와 Taekijip Ha 박사를 인정하고 싶습니다.
ES-C 현재 주소 : 면역 역학 그룹, 통합 암 면역학 실험실, 암 연구 센터, 국립 암 연구소, 베데스다

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브MTC BioC2000
10mM Tris-HCl pH 7.4
10mM Tris-HCl pH 8.0/ 50mM NaClT50 버퍼
100mm 조직 배양 접시CELLTREAT229620피라냐 에칭 유리/어레이
보관 15mL 원추형 튜브
16% 파라포름알데히드 수성 용액전자 현미경 과학15710위험
50mL 원뿔형 튜브기능화 유리 저장 / KOH 재사용
50 mM Tris-HCl pH 7.2 / 150 mM NaCl용해 완충액 구성 요소
60 mm 조직 배양 접시코닝430166
8 % 글루 타르 알데히드 수용액전자 현미경 과학16020유해
아세톤(C3H6O)Millipore Sigma270725Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr 항체 (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA 단백질 분석 키트Pierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
소 혈청 알부민Gold BiotechnologyA-420-1Tyrode의 완충 성분
Buchner 깔때기
Bunsen 버너
염화칼슘 (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode의 완충 성분
세포 스크레이퍼Bioworld30900017-1
원뿔형 필터링 플라스크피셔 ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II 자동 세포 계수Thermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5전자 현미경 과학63793
DipImage
https://diplib.org/ DMEMCaisson LabsDML19-500
emCCD 카메라Andor iXon
태아 소 혈청, OptimaBio-TechneS12450H열 비활성화
Fusion 360 소프트웨어Autodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
빙하 아세트산(CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01위험
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)MilliporeSigma D9434Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446lysis buffer component
hepesmillipore sigmah3375Tyrode의 완충액 성분
염산 (HCl)VWRBDH7204-1유해
과산화수소 (H2O2) (3%)HX0645
과산화수소 (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896용해 완충액 구성 요소
ImmEdge 소수성 배리어 펜Vector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F 이멀젼 오일Zeiss444960-0000-000
사내 진공 라인
L-글루타민Thermo Fisher Scientific25030-164
염화마그네슘 육수화물(MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode의 버퍼 구성 요소
, MatlabMathworks곡선 피팅 도구 상자, 병렬 컴퓨팅 도구 상자, 통계 및 기계 학습 도구 상자,
메탄올(CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1위험한
Milli-Q 물
Mix-n-Stain CF 염료 항체 라벨링 키트Biotium92245제안된 접합 키트
mPEGLaysan Bio, mPEG-숙시니미딜 발레레이트, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilaneUCT United ChemicalA0700위험한
나노그리드Miraloma Tech
NeutrAvidin 비오틴 결합 단백질Thermo Fisher Scientific31000
질소(압축 가스)
NVIDIA GPU with CUDAhttps://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 MicroscopeOlympus
Parafilm M Sealing FilmThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 아날로그 핫 플레이트Corning6795-200
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
포스포-EGF 수용체(Tyr1068) (1H12) 마우스 mAb세포 신호 전달 기술2236BF
염화칼륨(KCl)밀리포어 시그마529552Tyrode의 버퍼 구성 요소
수산화칼륨 (KOH)Millipore Sigma1050330500Hazardous
Premium PLA 필라멘트, 직경 1.75 mm3DPMS : 2035U / RAR : 3028인쇄 온도 범위 : 205-235 ° C
Pro2 3D 프린터Raise 3D
Pyrex 1L 비커
PYREX 100mL 저장 병Corning1395-100CH3OH/C3H6O 재사용
Pyrex 250mL 비커
Pyrex 4L 비커
Quad-view 이미지 SplitterPhotometricsModel QV2
냉장 원심분리기EppendorfEP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting SlidesVWR10027-446
Semrock 방출 필터: 청색(445/45 nm), 녹색(525/45 nm), 적색(600/37 nm), 원적외선(685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
혈청학 피펫 컨트롤러
혈청학 피펫은
단일 분자 분석 패키지https://github.com/LidkeLab/smite.git
중탄산 나트륨 (NaHCO3)Sigma AldrichS6014유해
붕소 수소화 나트륨 (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode ' s 완충
성분 염화나트륨 (NaCl)Millipore SigmaS9625연속적인 열과 pH 순환에 의해 활성화
수산화나트륨VWRBDH3247-1
오르토바나데이트 나트륨 (Na3VO4)Millipore SigmaS6508유해
황산 (H2SO4)Millipore Sigma258105Hazardous
TetraSpeck 마이크로스피어Thermo Fisher ScientificT7279다중 형광 비드
Tris (Trizma) 베이스Millipore SigmaT1503
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300120
, 기 , , 에서 호환성 확인 액

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

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