종에 구애받지 않는 단일 조직 응용 분야를 위한 레이저 미세 해부

요약

RNA 시퀀싱을 위해 개별 선충류 조직을 분리하기 위해 레이저 미세 해부를 사용하는 프로토콜이 기술되어 있습니다. 이 프로토콜은 종 특이적 유전자 툴킷을 필요로하지 않으므로 단일 조직 샘플 수준에서 다른 종간에 유전자 발현 프로필을 비교할 수 있습니다.

초록

단일 세포 방법론은 특정 세포 유형의 전사체 분석에 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 그들은 종종 형광 단백질의 조직 특이적 발현을 유도하는 프로모터와 같은 종 특이적 유전 적 "툴킷"을 필요로합니다. 또한, 개별 세포를 분리하기 위해 조직을 교란시키는 프로토콜은 그들의 천연 환경으로부터 세포를 제거하고(예를 들어, 이웃으로부터의 신호전달), 스트레스 반응 또는 천연 유전자 발현 상태로부터의 다른 차이를 초래할 수 있다. 본 프로토콜에서, 레이저 미세해부(LMD)는 수컷 꼬리 팁 형태형성 동안 유전자 발현의 연구를 위해 개별 선충류 꼬리 팁을 분리하도록 최적화된다.

LMD는 세포 파괴 또는 종별 툴킷이 필요없이 동물의 일부를 분리 할 수 있으므로 모든 종에 적용 할 수 있습니다. 이어서, CEL-Seq2와 같은 단세포 RNA-seq 라이브러리 준비 프로토콜은 LMD 단리된 단일 조직에 적용될 수 있고, 종에 대해 잘 주석이 달린 게놈 또는 전사체가 이용가능하다는 점을 감안할 때, 표준 파이프라인을 사용하여 분석될 수 있다. 이러한 데이터는 전사체가 상이한 종에서 그 조직의 발달의 기초가 되는 얼마나 보존되거나 상이한지를 확립하는데 사용될 수 있다.

한계에는 관심있는 조직 및 샘플 크기를 절단하는 능력이 포함됩니다. 전력 분석에 따르면 조건당 70개의 테일 팁이 80%의 전력에 필요한 것으로 나타났습니다. 동일한 발달 단계에서이 수의 동물을 얻기 위해서는 개발의 긴밀한 동기화가 필요합니다. 따라서, 1 h 간격으로 동물을 동기화하는 방법이 또한 설명된다.

서론

선충류, 특히 모델 시스템 Caenorhabditis elegans와 관련된 횡문근 선충류는 여러 가지 이유로 진화 발달 생물학 (EDB)을위한 훌륭한 동물 그룹입니다 ^1,2. 장점은 적은 수의 세포, 정의되고 일관된 세포 계보, 투명성 및 배양 및 축산업의 용이성을 포함합니다. 또한 여러 종에 대한 고품질 게놈과 C. elegans, 광범위한 분자 유전 도구 및 개발, 유전학, 해부학 및 생리학에 대한 지식 3,4,5,6을 포함하여 많은 자원을 사용할 수 있습니다.

다른 많은 유기체와 마찬가지로, 단일 조직 또는 단일 세포에서 전사체 역학 을 특성화하는 능력은 C. elegans 7,8,9,10의 발달 분석에 혁명을 일으켰습니다. 선충류에 걸친 단일 세포 전사체를 비교할 수 있다는 것은 이러한 유기체를 사용하여 EDB를 유사하게 변형시킬 것입니다. 예를 들어, 이러한 비교는 유전자 조절 네트워크가 보존 된 캐릭터 (특성), 발산 된 캐릭터 또는 독립적으로 진화 한 캐릭터에 대해 어떻게 진화했는지에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.

그러나 선충류로부터 특정 조직이나 세포를 분리하는 것은 큰 도전 중 하나입니다. 많은 유기체에 대해, 단일 세포는 조직으로부터 해리되고 편향되지 않은 방식으로 수확될 수 있거나, 형광 단백질의 조직 특이적 발현으로 표지될 수 있고, 형광-활성화된 세포 분류(FACS)¹¹에 의해 분류될 수 있다. C. elegans에서, 세포의 고처리량 (HTP) 분리는 거친 외부 표피 (및 수압 골격)가 유충 및 성인으로부터의 세포 분리를 방해했기 때문에 주로 배아로 제한되었습니다. 이러한 도전을 해결하기 위해, 일부 방법들은 조직 특이적 mRNA-태깅¹²와 같은 전체 C. elegans 웜에서 유전 도구를 사용하고, 야생형과 세포 유형¹³에 영향을 미치는 돌연변이체 사이의 차등 발현 비교를 이용하였다. 보다 최근의 방법들은 핵(14) 또는 전체 세포(^8,9,15)를 분리하기 위해 큐티클을 용해시킴으로써 도전을 극복하였다. 그러나 세포 분리 및 세포 배양은 세포가 그들의 자연적 발달 또는 해부학적 맥락으로부터 제거된다는 명백한 단점을 갖는다 - 예를 들어, 세포-세포 신호전달로부터 멀어지고 세포외 매트릭스와의 접촉 - 이는 유전자 발현 프로필⁽¹⁵)에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 더욱이, 유전 도구 및 조직-특이적 마커는 종-특이적이다(즉, 이들은 C. elegans에서만 사용될 수 있다).

LMD는 세포의 자연적인 맥락을 방해하지 않고 조직을 분리하는 대안적인 방법을 제공합니다. EDB의 경우, LMD는 또한 이들 종의 게놈 또는 전체 전사체 서열이 이용 가능한 경우 종 특이적 유전자 툴킷을 필요로 하지 않고 상이한 종의 상동성 조직으로부터의 전사체를 비교할 수 있게 한다. LMD는 직접적인 현미경 관찰에 의해 조직을 표적화하고 현미경의 광학에 통합 된 레이저 마이크로 빔을 사용하여 관심있는 조직을 잘라내어 수확 (캡처)하는 것을 포함합니다¹⁶. LMD의 한계는 매우 HTP 접근법에 도움이되지 않는다는 것입니다 (이 프로토콜에 설명 된 바와 같이 꼬리 팁에 대한 전사 프로파일은 ~ 70 개의 샘플로 견고 함), 특정 샘플은 해부하기가 어려울 수 있으며 절단은 레이저의 정밀도와 현미경에서 시각화 할 수있는 것으로 제한됩니다.

본 프로토콜의 목적은 LMD가 단일 조직 RNA-Seq에 이어 선충류로부터 단계- 및 조직 특이적 전사체 데이터를 수득하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 기술하는 것이다. 구체적으로, 그것은 C. elegans의 4 단계 유충 (L4)에서 꼬리 끝을 분리하기위한 LMD를 보여줍니다. 그러나, 이 방법은 다른 조직 및 물론, 상이한 종에 적응될 수 있다.

C. elegans에는 남성과 hermaphrodites 모두에서 꼬리 끝을 만드는 4 개의 세포가 있습니다. 남성의 L4 단계 동안 - 헤르마프로디트에서는 그렇지 않지만 꼬리 끝 세포는 모양을 바꾸고 전방 및 내측으로 이동합니다. 이 과정은 또한 일부 다른 횡문근 선충류 종에서 발생하지만 전부는 아닙니다. 따라서 꼬리 끝은 성적 이형 형태 형성의 진화를위한 좋은 모델입니다. 위치 때문에 꼬리 끝은 LMD에 의해 쉽게 분리 될 수 있습니다.

꼬리 팁으로부터 전사체 프로파일을 얻기 위해, 본 프로토콜은 단일 세포^17,18을 위해 개발된 RNA-seq 방법인 CEL-Seq2를 사용한다. 이 방법은 LMD 유래 조직에 대해 몇 가지 장점이 있습니다. CEL-Seq2는 mRNA 판독의 간단한 정량화, 선형 증폭을 보장하기 위한 시험관내 전사, 개별 조직 샘플의 멀티플렉싱을 허용하는 바코딩을 허용하는 고유한 분자 식별자(UMI)를 사용하여 매우 민감하고 효율적입니다. CEL-Seq2의 유일한 한계는 회수된 판독이 mRNA의 3' 말단에 편향되어 있고, 따라서 대부분의 이소형은 구별될 수 없다는 것이다.

프로토콜

1. 웜 동기화

참고 : C. elegans 및 다른 rhabditid 종의 발달을 동기화하기 위해 두 가지 방법이 아래에 설명되어 있습니다.

1. 알칼리성 차아염소산염 (표백제) 처리 후 첫 번째 애벌레 단계 (L1) 정지에 의해 동기화하십시오.
   참고: 이 방법은 앞에서¹⁹에서 자세히 설명했습니다. 이 방법은 다른 여러 횡문근 종에도 해당되는 C. elegans 의 두 가지 특징에 의존합니다 : (1) 달걀 껍질은 표백제에 내성이 있지만 성인과 애벌레 벌레를 둘러싼 표피는 그렇지 않습니다. (2) 1 단계 유충은 음식없이 보관 할 때 발달을 멈 춥니 다.²⁰.
   1. gravid hermaphrodites (또는 암컷)를 희석 표백제로 처리하여 표피를 분해하고 배아를 방출하십시오.
   2. 표백제에서 배아를 제거하고 모든 L1이 부화 할 때까지 음식없이 보관하십시오.
   3. 체포 된 L1을 음식에 올려 놓으면 거의 동시에 개발을 재개 할 수 있습니다.
      참고: L1 체포에서 종료는 1시간 이내에 발생할 수 있습니다.
2. "해치 오프"방법과의 동기화 (여기에서 사용됨; 그림 1 위쪽:
   참고: 해치 오프 방법은 개발 중단 없이 긴밀한 동기화를 가능하게 합니다(L1 정지는 이후 단계²¹의 개발에도 영향을 미칩니다). 프로토콜은 Pepper et ^al.22에서 채택되었습니다. 이 방법의 목적은 배아만을 포함하는 플레이트에서 특정 기간 동안 부화 한 L1을 수집하는 것입니다.
   1. 어머니 선택 : 해치오프를 수행하기 전날 저녁에, 대장균 OP50으로 씨를 뿌린 접시에 ~30개의 그라비드 헤르마프로디트를 골라 넣는다.
   2. 하룻밤 동안 알을 낳기 위해 25°C에서 배양한다.
      참고 : 웜이 붙어있을 수있는 균열이나 거품이없는 접시를 선택하십시오. 나중에 모든 웜을 제거하기가 어려울 것이므로 매우 두꺼운 박테리아 잔디밭이있는 접시를 피하십시오. 온도에 민감한 균주로 작업하는 경우 더 긴 배아 발생을 고려하여 알을 낳는 시간을 조정하십시오. 최대 알을 낳는 단계에서 어머니를 선택하십시오.
   3. 어머니와 애벌레를 제거하십시오 : 다음날 아침, 해부 현미경 (20x 배율) 아래, 분출하지 않고 플레이트의 벽에 대해 M9 버퍼 1-2 mL를 부드럽게 피펫하십시오. 웜을 제거하기 위해 접시를 소용돌이 치십시오.
   4. 구멍이 파지 않도록 한천 가장자리의 플레이트 벽에 피펫 팁을 배치하여 모든 액체와 웜을 제거하고 버립니다. 접시에 웜 (그리고 계란 / 배아 만)이 남아 있지 않은지, 특히 L1이 아닌지 확인하십시오. 그렇지 않으면 세척을 반복하십시오.
   5. 플레이트를 25°C에서 1시간 동안 놓고 일부 L1이 부화할 때까지 기다립니다.
   6. 새로 부화한 L1을 수집: 1mL M9 버퍼를 한천에 조심스럽게 떨어뜨립니다. 플레이트를 소용돌이 치며 L1을 제거하지만 배아는 제거하지 마십시오. 부드럽게 피펫 버퍼와 웜을 1 mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
   7. 튜브를 ∼18,000 × g에서 1분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하십시오.
   8. 피펫 L1을 씨를 뿌린 플레이트의 박테리아 잔디밭에 직접 놓습니다. 해부 현미경에서 성인 웜이나 배아가 없는지 확인하십시오.
   9. 웜이 원하는 단계로 발전 할 때까지 25 ° C에서 유지하십시오.
      참고: 조건이 최적이면 동일한 플레이트에서 L1 배치를 두 개 더 수집할 수 있습니다. 초기 플레이트를 검사하여 L1이 없는지 확인합니다. 필요한 경우 다시 씻으십시오. 1.2.5-1.2.9단계를 반복합니다.
   10. 발달 타이밍을 확인하십시오. 다운스트림 적용을 진행하기 전에 400x 배율의 복합 현미경으로 일부 웜을 검사하여 원하는 발달 단계 인 L3에 도달했는지 확인하십시오.
       참고: 원위 팁 세포 또는 링커 세포의 이동 거리는 외음부 발달 이외에 가이드로 사용할 수 있습니다. 외음부 발달을 위해, Mock et al.23은 유용한 가이드를 제공하지만, 그 연구에서의 타이밍은 ²⁰ °C에서 결정되었다. 25°C에서, 야생형 C. 엘레간은 부화 후 24시간 후에 L3-L4 털갈이를 겪을 것이다.

2. L4 수컷과 헤르마프로디테 수집 및 고정

1. 고정 전에 RNAse가 없는, 차가운 (-20°C), 70% 메탄올을 준비하십시오.
2. 30-50x 배율의 해부 현미경 하에서, 성별을 구별 할 수있는 즉시 동기화 플레이트에서 수컷과 헤르마프로디트를 별도의 시드되지 않은 플레이트 (부화 후 ~ 21 시간, 그림 2)로 채취하기 시작하고 1-2 시간 동안 또는 200 마리의 동물이 수집 될 때까지 계속 채취하십시오.
3. 웜이 실험의 원하는 단계에 도달 할 때까지 25 °C에서 유지하십시오.
4. 0.01 % 세제를 함유 한 M9 버퍼로 미리 세척 된 피펫 팁을 사용하여 1-2 mL의 M9 버퍼로 플레이트에서 웜을 씻어냅니다 (웜이 팁에 달라 붙지 않도록).
5. 웜을 1 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
6. 21,000 × g 에서 1 분 동안 회전하여 웜을 펠릿화하십시오. 상층액을 제거하십시오.
7. M9 버퍼 1 mL를 첨가하고 혼합하여 펠렛을 분해한다.
8. 21,000 × g 에서 1 분 동안 회전하여 웜을 펠릿화하십시오. 상층액을 제거하십시오.
9. 세척을 반복하십시오.
10. 빙냉 70% 메탄올 1mL를 넣고 잘 섞는다.
11. 웜을 펠릿화하기 위해 21,000 × g 에서 1 분 동안 회전하십시오. 상층액을 제거하십시오.
12. 2.10단계와 2.11단계를 반복합니다.
13. 500 μL의 70% 메탄올을 첨가하고, 혼합하고, 4°C에서 1시간 내지 하룻밤 동안 저장한다.

3. 레이저 미세 해부

참고 : 여기서부터 RNase가없는 시약과 소모품을 사용하십시오. 필터 팁을 사용하십시오.

1. 샘플을 처리하기 위해 CEL-Seq2 방법이 사용되는 경우, 각 CEL-Seq2 프라이머에 대한 마스터 믹스를 준비하십시오 (보충 표 S1): 2 μL의 CEL-Seq2 프라이머, 1 μL의 10 mM dNTP 및 9 μL의 1% β-메르캅토에탄올 (RNase-free 물에서)을 표지된 200 μL 튜브에 넣는다.
2. 슬라이드에 장착
   1. 해부 현미경 하에서, 20 μL의 고정된 웜(단계 2.13으로부터의 20-40 웜)을 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN)-막 유리 슬라이드(여기서 멤브레인이 있는 곳)의 무광택 측면 상에 피펫한다.
   2. 메탄올이 증발 할 때까지 기다리십시오. 슬라이드 워머를 사용하여 증발 속도를 높입니다.
      참고 : 메탄올의 추가 방울을 적용 할 수 있으며, 피펫 팁은 웜이 건조함에 따라 덩어리지기 시작하면 웜을 퍼뜨리는 데 사용됩니다. 웜이 덩어리에있을 때, 그들은 해부하기가 어려울 수 있습니다.
3. 현미경 설정
   참고: 다음 프로토콜은 재료 표에 나열된 계측기에만 해당됩니다. 다른 LMD 현미경을 사용하는 경우 조정해야합니다.
   1. LMD 현미경의 측면에 있는 스테이지 뒤에 데스크탑 가습기를 놓습니다. 증기가 무대에 직접 불고 있는지 확인하십시오.
      참고: 가습기는 정전기를 줄이는 데 도움이 되며, 그렇지 않으면 작은 멤브레인 섹션이 튜브 캡으로 떨어지는 것을 방지할 수 있습니다.
   2. 레이저 파워를 위해 키를 돌립니다.
   3. 스테이지 제어 전원을 켭니다.
   4. 현미경 컨트롤 박스를 켭니다.
   5. 레이저 미세 해부 소프트웨어를 엽니 다.
   6. 무대 위의 플라스틱 실드를 제거하십시오.
   7. 위쪽 화살표가 있는 언로드 버튼을 클릭하여 멤브레인 슬라이드를 로드 합니다.
   8. 슬라이드가 완전히 건조했는지 확인하고 멤브레인이 아래를 향하도록 뒤집습니다.
   9. 슬라이드를 삽입하고 변경 표본 창에서 계속을 클릭합니다.
   10. 플라스틱 실드를 교체합니다.
   11. 화면 아래쪽에서 슬라이드가 포함된 슬라이드 홀더를 선택합니다.
   12. 튜브를 로드하려면 아래쪽 화살표가 있는 언로드 단추를 클릭합니다.
   13. 트레이를 당겨 튜브 블록을 분리합니다.
       참고: 이 실험에 사용된 튜브 블록은 500 μL PCR 튜브용입니다.
   14. 500 μL PCR 튜브의 튜브 캡을 홀더에 넣고 튜브를 아래로 접습니다.
   15. 블록을 트레이로 되돌리고 트레이를 현미경 스테이지로 다시 밀어 넣습니다.
   16. 변경 수집기 장치 팝업 창에서 PCR 튜브를 선택하고 확인을 클릭합니다.
   17. 화면 왼쪽 하단의 콜렉터 장치 튜브 캡 아래의 빈 튜브 위치를 클릭합니다.
   18. 현미경 제어판에서 투과광 밝기 필드 조명을 위해 TL-BF를 선택합니다.
4. 절단
   참고: 이 프로토콜은 재료 표에 나열된 계측기에 대해 특정한 프로토콜입니다.
   1. 2.5x 렌즈를 사용하여 웜과 멤브레인의 구조가 보일 때까지 초점을 조정합니다.
   2. 20x 렌즈로 전환합니다.
   3. 스테이지를 웜이 없는 영역으로 이동합니다. 멤브레인의 버블 형상 구조가 황색을 띠도록 초점을 조정하고(그림 3A,B) 레이저를 올바른 초점면에 초점을 맞춥니다.
   4. 레이저 매개 변수를 설정하십시오. 꼬리 팁의 경우 Power 45, 조리개 30 및 속도 20으로 시작하십시오.
   5. 레이저 제어판에서 보정을 선택합니다. 지침을 따릅니다.
      주: 계측기는 이 단계를 자동으로 수행합니다. 화면에서 마우스로 그린 모양이 레이저로 잘라낸 모양과 동일한지 확인합니다.
   6. 컬렉터 장치 튜브 캡의 화면 하단에서 위치 A를 클릭합니다.
   7. 화면 오른쪽에서 단일 도형을 선택합| 그리기 + 잘라 내기. 화면 왼쪽에서 PtoP를 선택합니다.
   8. 선을 그립니다.
   9. 컷 시작을 클릭하여 레이저가 멤브레인을 통과하도록 합니다.
      참고 : 유리에 선을 에칭 할 수도 있습니다.
   10. 이 테스트 컷이 좋아 보이면 (멤브레인이 잘리고 절단 가장자리가 매끄럽게 보임) 다음 단계를 계속하십시오. 그렇지 않으면 초점을 조정하고 다른 선을 자릅니다.
   11. 웜을 찾습니다. 이동 + 잘라내 기로 전환하고 마우스를 사용하여 꼬리를 자릅니다.
       주: 레이저가 꼬리를 뚫지 않으면 초점을 조정하고 레이저 파워를 높입니다. 더 두꺼운 조직의 경우, 레이저 파워는 60으로 설정되어야 할 수 있다.
   12. 매개 변수 저장: 파일 탭 | 응용 프로그램 구성 저장; 나중에 검색하려면 응용 프로그램 구성을 복원합니다.
   13. 샘플을 수집하려면 PtoP 기능을 사용하여 그리기 + 컷 설정으로 전환하고 모양을 그려 멤브레인 섹션의 절단을 완료합니다(그림 3C).
       참고: 원이나 타원형이 아닌 사각형이나 삼각형 모양의 큰 멤브레인 섹션과 섹션은 컬렉터 튜브 캡에서 쉽게 찾을 수 있습니다.
   14. 화면 하단의 Collector Device Tube Cap 에서 다음 튜브를 선택하고 다음 꼬리 팁을 자릅니다.
   15. 네 개의 꼬리가 잘리면 튜브 랙을 언로드하고(아래쪽 화살표로 언로드 클릭) 해부 현미경 아래에서 멤브레인 섹션을 찾습니다(그림 3D).
       참고: 섹션은 튜브 캡의 중앙에 있거나 캡의 측면에 달라붙을 수 있습니다.
   16. 다운스트림 응용 프로그램을 계속 진행합니다. CEL-Seq2의 경우, 1.2 μL의 CEL-Seq2 프라이머 마스터 믹스 (단계 3.1로부터)를 피펫 샘플의 상부에 직접 상파한다.
   17. 튜브를 닫고 프라이머 번호로 라벨을 붙이고 즉시 튜브 캡을 드라이 아이스 조각에 직접 올려 놓고 샘플을 플래시-동결시키고 RNA 분해를 방지합니다.
   18. 더 많은 튜브를로드하고, 튜브 블록을 무대로 되돌리고, 더 많은 샘플을 자릅니다. 다른 CEL-Seq2 프라이머 믹스를 각 꼬리 팁에 첨가한다.
   19. 모든 튜브를 -70°C에 보관하십시오.

4. CEL-Seq2를 사용한 단일 꼬리 RNA 시퀀싱

참고: CEL-Seq2 프로토콜에 대한 자세한 내용은 Yanai 및 Hashimshony¹⁸을 참조하십시오.

1. RNase 오염 제거 용액으로 실험실 벤치 영역을 청소하여 RNA 분해를 방지하십시오.
2. 마스터 믹스를 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
   1. 역전사 마스터 믹스를 제조한다: 샘플 당 0.4 μL의 제1 가닥 완충액, 0.1 μL의 0.1M DTT, 0.1 μL의 RNase 억제제, 및 0.1 μL의 역전사 효소.
   2. 두 번째 가닥 반응 마스터 믹스를 준비한다: 7 μL의 물, 2.31 μL의 두 번째 가닥 완충액, 0.23 μL의 dNTP, 0.08 μL의 대장균 리가아제, 0.3 μL의 대장균 DNA 중합 효소, 샘플 당 0.08 μL의 RNaseH.
3. 열린 세포를 파괴하고 프라이머로 어닐링(프라이머의 전체 목록은 보충표 S1 참조):
   1. 열순환기 및 그 뚜껑을 65°C로 프로그래밍한다.
   2. 샘플을 -70°C에서 검색하고, 이를 2.5분 동안 열순환기에서 인큐베이션한다.
   3. 21,000 × g 에서 30-40 초 동안 회전하십시오.
   4. 65°C에서 2.5분 동안 인큐베이션한다.
   5. 즉시 얼음으로 옮깁니다.
   6. 21,000 × g 에서 30-40 초 동안 회전하여 얼음으로 되돌립니다.
4. RNA를 cDNA로 변환 :
   1. 0.8 μL의 역전사 믹스를 각 꼬리 팁에 첨가한다.
   2. 42°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   3. 70°C에서 10분 동안 열-불활성화시킨다.
   4. 즉시 얼음으로 옮깁니다.
   5. 두 번째 가닥 믹스 10 μL를 각 꼬리 팁에 첨가한다.
   6. 샘플을 휙휙 휙니다.
   7. 21,000 × g 에서 30-40 초 동안 회전하십시오.
   8. 16°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
5. cDNA 정리 :
   1. DNA 클린업 비드를 실온으로 미리 데우십시오.
   2. 최대 40개의 샘플을 1.5 mL 원심분리 튜브(최대 480 μL)에 모으십시오.
   3. 비드가 잘 분산될 때까지 혼합하고, 풀링된 샘플 100μL마다 20μL의 비드와 100μL의 비드 결합 완충액을 첨가한다(샘플 480μL의 경우 비드 버퍼 480μL와 비드 96μL를 최종 부피 최대 1,056μL까지 첨가). 피펫팅으로 잘 섞으십시오.
   4. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
   5. 액체가 맑게 나타날 때까지 적어도 5 분 동안 마그네틱 스탠드에 놓습니다.
   6. 20 μL의 상청액을 제외한 모든 것을 제거하고 버린다.
   7. 갓 준비한 80% 에탄올 200μL를 첨가한다.
   8. 적어도 30 초 동안 인큐베이션하고, 비드를 방해하지 않고 피펫팅하여 상청액을 제거한다. 상층액을 버리십시오.
   9. 4.5.7단계와 4.5.8단계를 한 번 반복합니다.
   10. 구슬을 15 분 동안 또는 완전히 건조 될 때까지 공기 건조시킵니다.
   11. 비드 (~ 6.4 μL)를 6.4 μL의 물로 재현탁하십시오. 전체 볼륨을 열 번 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하십시오.
   12. 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
   13. 시험관내 전사 (IVT)로 곧장 가십시오.
6. 시험관내 전사 및 단편화:
   1. 6.4 μL의 샘플 및 비드를 함유하는 튜브에, 1.6 μL의 10x T7 완충액, 1.6 μL의 ATP, 1.6 μL의 UTP, 1.6 μL의 CTP, 및 1.6 μL의 GTP (75 mM 농도에서 각각 dNTP) 1.6 μL의 T7 효소를 첨가한다.
   2. 4°C 홀드와 함께 37°C에서 13시간 동안 인큐베이션한다.
   3. 엑소뉴클레아제 용액 6 μL를 첨가한다(최종 부피는 22 μL이어야 한다).
   4. 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
   5. 튜브를 다시 얼음 위에 놓고 5.5 μL의 단편화 완충액 (0.25 × 반응 부피)을 첨가한다.
   6. 94°C에서 3분 동안 인큐베이션한다.
   7. 튜브를 즉시 얼음으로 옮기고 2.75 μL의 단편화 정지 버퍼 (0.5 × 부피의 단편화 버퍼 추가)를 첨가하십시오.
   8. 액체가 맑게 나타날 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드 위에 적어도 5 분 동안 올려 놓음으로써 비드를 제거하십시오.
   9. 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.
7. 증폭된 RNA (aRNA) 정리:
   1. RNA 클린업 비드를 실온으로 미리 따뜻하게 합니다.
   2. 구슬이 잘 분산 될 때까지 혼합하십시오.
   3. 55 μL의 비드 피펫 (1.8 × 반응 부피).
   4. 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
   5. 액체가 맑게 나타날 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드 위에 적어도 5 분 동안 놓습니다.
   6. 80 μL의 상청액을 제거하고 버린다.
   7. 갓 준비한 70% 에탄올 200μL를 첨가한다.
   8. 적어도 30초 동안 인큐베이션하고, 비드를 방해하지 않고 피펫팅함으로써 상층액을 제거한다. 상층액을 버리십시오.
   9. 에탄올 세척을 두 번 더 반복하십시오.
   10. 구슬을 15 분 동안 또는 완전히 건조 될 때까지 공기 건조시킵니다.
   11. 비드를 7 μL의 물로 재현탁시킨다. 전체 부피를 10 번 위아래로 피펫하여 완전히 혼합하십시오.
   12. 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
   13. 액체가 맑아 질 때까지 5 분 동안 마그네틱 스탠드에 비드가있는 튜브를 놓습니다.
   14. 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.
       참고 : 정지 지점 : 샘플은 -70 °C에서 보관할 수 있습니다.
8. 선택 사항: 제조업체의 프로토콜에 따라 자동화된 전기영동 시스템으로 aRNA 양과 품질을 확인합니다.
9. 도서관 준비 :
   1. 5 μL의 RNA에, 100 μL의 100 μM 랜덤 헥사머 RT 프라이머 ( 물질의 표 참조) 및 0.5 μL의 10 mM dNTP를 첨가한다.
   2. 65°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
   3. 실온에서 4 μL의 다음 믹스를 첨가한다: 2 μL의 퍼스트 스트랜드 버퍼, 1 μL의 0.1 M DDT, 0.5 μL의 RNase 억제제, 0.5 μL의 역전사효소.
   4. 25°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
   5. 42°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다(50°C로 설정된 뚜껑을 갖는 혼성화 오븐 또는 예열된 열 사이클러에서).
   6. 70°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
   7. 5 μL를 새로운 튜브로 옮긴다 (나머지 반응물을 -20°C에서 유지). 5.5 μL의 초순수, 1 μL의 RNA PCR 프라이머 (RP1), 1 μL의 인덱싱된 RNA PCR 프라이머 (RPIX) 및 12.5 μL의 PCR 믹스를 첨가한다.
   8. 열순환기에 다음 프로그램을 사용하십시오: 98°C에서 30초, 11사이클(98°C에서 10초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초), 72°C에서 10분, 4°C에서 유지.
      참고: 정지점: 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
10. 도서관 정리 :
    1. DNA 클린업 비드를 실온으로 미리 데우십시오.
    2. 구슬이 잘 분산 될 때까지 혼합하십시오.
    3. 25 μL의 비드를 PCR 반응에 첨가한다. 피펫팅으로 잘 섞으십시오.
    4. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
    5. 액체가 맑게 나타날 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드 위에 적어도 5 분 동안 놓습니다.
    6. 45 μL의 상청액을 제거하고 버린다.
    7. 갓 준비한 80% 에탄올 200μL를 첨가한다.
    8. 적어도 30 초 동안 인큐베이션하고, 비드를 방해하지 않고 상청액을 제거하고 버린다.
    9. 에탄올 세척을 한 번 반복하십시오.
    10. 공기 건조 비드는 15 분 동안 또는 완전히 건조 될 때까지 건조됩니다.
    11. 25 μL의 물로 재현탁하십시오. 피펫팅으로 잘 섞으십시오.
    12. 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
    13. 액체가 맑게 나타날 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 5 분 동안 놓습니다.
    14. 25 μL의 상청액을 새로운 튜브로 옮깁니다.
    15. 4.10.2-4.10.10단계를 한 번 반복합니다.
    16. 10.5 μL의 물로 재현탁하십시오. 피펫팅으로 잘 섞으십시오.
    17. 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
    18. 액체가 맑게 나타날 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 5 분 동안 놓습니다.
    19. 10 μL의 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 -20°C에서 보관한다.
11. 시퀀싱 시설의 요구 사항에 따라 도서관의 품질과 수량을 평가하십시오.

결과

레이저 캡처 미세 해부 후, 4 시간 지점에서 수컷과 헤르마프로디트의 개별 꼬리 끝 (부화 후 L3 22 시간; L4 24, 26, 및 28 h 해치 후)를 CEL-Seq2 프로토콜을 사용하여 RNA 시퀀싱을 위해 제조하였다. CEL-Seq2 프라이머는 특정 샘플(이 경우 개별 꼬리 팁)으로부터의 시퀀싱 판독이 생물정보적으로 확인될 수 있게 하는 독특한 바코드를 함유한다. 시퀀싱 데이터는 총 557 개의 꼬리 팁 (4 개의 발달 시점에 걸쳐 266 개의 헤르마프로디테와 291 마리의 남성, 성별 및 시점 당 59-78 개의 꼬리)에 대해이 방법으로 생성되었습니다. CEL-Seq2 바코드는 이들 꼬리 팁의 97%(즉, 543)에 대해 회수되었다(보충 표 S2). 대부분의 라이브러리에서 복구 속도는 99-100 %였습니다. 그러나 한 남성 시간대의 경우 88 %였습니다. 22, 24 및 28 시간 시점의 남성 꼬리 팁의 약 절반이 COVID-19 관련 지연으로 인해 ~ 4 개월 동안 -80 °C에서 저...

토론

방법의 중요한 단계
올바르게 수행되면, 여기에 설명된 방법은 상대적으로 적은 수의 레이저 해부된 샘플(이 예에서는 70개의 꼬리 팁)으로 강력한 RNA 프로파일을 얻을 수 있습니다. 그러나 개발 중인 동물의 샘플의 경우 시료 간의 변동성을 줄이기 위해 긴밀한 동기화가 중요합니다. 이러한 이유로 프로토콜은 웜 동기화를 위해 해치오프 방법을 권장합니다. 여기서 연구원은 개인 간의 연령 차이를 결정하고 정확하게 제어 할 수 있습니다 (현재 프로토콜의 1 시간). 또한, 해치-오프 방법은 배아가 표백제에 민감하더라도, L1이 정지되지 않거나, L1 정지로부터의 회복이 가변적이더라도 모든 종에 적용 가능하다. 해치 오프에 의한 성공적인 동기화를 위해서는 세척 단계가 중요합니다 : 부화 기간이 시작될 때 모든 성인과 애벌레를 제거해야하며 부화 기간이 끝날 때 새로 부화 한 L1과 함께 배아를 씻어 내서는 안됩니다. 이것은 플레이트의 한천 표면이 균열, 구멍 또는 거품에 의해 손상되지 않은 경우에만 성공하...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 & 마이크로; M PEN 멤브레인 유리 슬라이드 RNase free	Leica	11600288	LMD
500 µ L PCR 튜브 (뉴클레아제 없음)	Axygen	732-0675	꼬리 끝을
40x 대물렌즈 및 DIC			웜의 나이를 확인하기 위한
모든 데스크탑 가습기
해부 현미경		모든 웜 작업
유리 슬라이드 및 커버슬립	웜의 나이를 확인하기 위한	모든
LMD6 미세해부 시스템	Leica	다중	절단 꼬리 팁
LoBind 튜브 0.5 mL	Eppendorf	22431005
M9 WormBook
메탄올 99.8%	Sigma	322415	벌레 수정
Simulator, NGM 성장 매체	US 생물학적	N1000	완충액 및 염 추가 필요: WormBook
P10 피펫 가변 부피	레시피(예: Gilson
P1000 피펫 가변 용량	예: Gilson
P2 피펫 가변 용량	예: Gilson
피펫 팁 1,000 &마이크로); L	모든
피펫 팁 1-10 µ L은	모든
백금 이리듐 와이어	Tritech	PT-9010	을 필터링하여 웜 픽
멸균 및 뉴클레아제가 없는 1mL 원심분리기 튜브	를
Tween 20	Sigma	P9416	M9 버퍼에 매우 소량을 추가하여 웜이 피펫 팁에 달라붙는 것을 방지하고
6mm 플라스틱 페트리 접시
를 통기합니다.고
4200 TapeStation 시스템	Aligent		자동 전기영동 시스템
AMPure XP 비드	Beckman Coulter	A63880	DNA 클린업 비드
비드 결합 완충액  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 프라이머 (표 S1 참조)	Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf	6335000020	프로그래밍 가능한 뚜껑과 블록이 있는 열 순환기; l 튜브.
DNA 중합효소 I (E. coli)	Invitrogen	18052-025
dNTP mix 10 mM	any
E. coli DNA	ligase Invitrogen	18052-019
에탄올
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200	엑소뉴클레아제 용액
MEGAscript T7 전사 키트	Ambion	AM1334	단계 4.6.1
뉴클레아제가 없는 물	Phusion
High-Fidelity PCR 마스터 믹스	NEB	M0531	PCR 믹스 단계 4.9.7
무작위 헥사머 RT 프라이머 GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN	IDT		인 6개의 뉴클레오티드가 있는 프라이머
		E6150S
RNA 단편화 정지 버퍼	NEB	E6150S
RNA PCR 인덱스 프라이머 (RPI1– RPI48)	프로토콜 단계 4.9.7의	Illumina, NEB 또는 IDT
RNAClean XP 비드	Beckman Coulter	A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Scientific	7000TS1	또는 기타 유사한 제품
RNaseH (E. coli)	Invitrogen	18021-071
RNaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제	인비트로겐	10777-019
두 번째 가닥 완충제	인비트로겐	10812-014
슈퍼스크립핏 II	인비트로겐	18064-014	역전사효소