광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

요약

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

초록

미오신은 ATP를 가수분해하여 액틴 필라멘트(AF) 트랙을 따라 이동하는 운동 단백질이며 운동성 및 근육 수축과 같은 세포 과정에 필수적입니다. 힘 생성 메커니즘을 이해하기 위해 미오신 II는 단일 분자 (SM) 수준과 광학 트래핑과 같은 생물 물리학 적 방법을 사용하는 시험관 내 모터 팀으로 조사되었습니다.

이 연구는 미오신 힘 생성 거동이 3 비드 배열의 단일 분자 수준에서 글라이딩 배열의 단단한 비드 또는 커버 슬립 표면에서 함께 작동하는 모터 그룹으로 이동할 때 크게 다를 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 이러한 분석 구조는 세포 내에서와 같이 점탄성 구조 계층 내에서 미오신의 그룹 역학을 평가하는 것을 허용하지 않습니다. 우리는 여러 액틴 필라멘트와 상호 작용하는 미오신 앙상블에 의한 힘 생성 메커니즘을 조사하기 위해 광학 핀셋을 사용하는 방법을 개발했습니다.

이러한 액토미오신 번들은 모터 통신 및 앙상블 힘 출력을 캡처하는 계층적이고 규정을 준수하는 환경에서 조사를 용이하게 합니다. 분석의 사용자 정의 가능한 특성을 통해 실험 조건을 변경하여 미오신 앙상블, 액틴 필라멘트 번들 또는 주변 환경에 대한 수정이 어떻게 다른 힘 출력을 초래하는지 이해할 수 있습니다.

서론

운동 단백질은 생명에 필수적이며 화학 에너지를 기계적 작업으로 변환합니다 ^1,2,3. 미오신 모터는 트랙과 유사한 필라멘트를 따라 단계를 밟아 액틴 필라멘트와 상호 작용하며, 액틴-미오신 네트워크의 역학은 근육 수축, 세포 운동성, 세포질 분열 중 수축 고리 및 세포 내부의화물 이동을 수행합니다. 3,4,5,6,7,8 . 미오신은 많은 필수 역할을 하기 때문에 미오신 액틴 네트워크의 기능 장애는 비대성 심근병증(HCM)에서 심장 과수축을 유발하는 미오신 중쇄의 돌연변이와 같은 질병 발병으로 이어질 수 있습니다.9,10,11,12,13,14

프로토콜

1. 에칭 커버슬립

1. 1,000mL 비커에 100% 에탄올 300mL에 KOH 100g을 녹입니다. 대부분의 KOH가 녹을 때까지 교반 막대로 저어줍니다.
   주의 : 농축 KOH 용액은 화상을 입거나 의복을 손상시킬 수 있습니다. 장갑, 보안경 및 실험실 코트를 착용하십시오.
2. 커버슬립을 커버슬립 청소용 랙에 개별적으로 놓습니다.
   알림: 랙은 커버슬립의 각 면, 바닥의 배수구에서 에칭 및 헹굼이 가능하도록 단일 커버슬립을 간격을 두고 유지하는 슬릿으로 설계되었으며 가혹한 에칭 조건을 견딜 수 있는 재료로 만들어졌습니다. 그들은 맞춤 제작되거나 상업적으로 구입할 수 있습니다.
3. 3개의 1,000mL 비커(300mL의 에탄올이 있는 비커와 300mL의 역삼투압(RO) 물이 있는 비커 2개를 준비하고 라벨을 붙입니다.
   알림: 여기에서 RO 물은 실험실 정수기에서 공급되었지만 지역 정수기를 사용할 수 없는 경우 상업적으로 구입할 수도 있습니다.
4. 4 개의 비커 각각을 욕조 초음파 처리기에 넣어 5 분 동안 가스를 제거합니다.
5. KOH와 에탄올의 비커에 커버 슬립 랙을 담그고 5 분 동안 초음파 처리합니다.
6. 커버슬립 랙을 KOH/에탄올 비커에서 에탄올 전용 비....

결과

액토미오신 번들 시스템을 포함하는 플로우 셀은 현미경 슬라이드와 양면 접착 테이프로 만든 채널로 분리된 에칭된 커버슬립으로 구성된 표준 설계입니다(그림 1). 그런 다음 분석은 프로토콜에 설명된 대로 단계적 소개를 사용하여 커버슬립에서 구축됩니다. 최종 분석은 주형 로다민 표지 액틴 필라멘트로 구성됩니다. 원하는 미오신 농도 (1 μM이 도 2 및 도 3의 대표적인 결과를 위해 사용되었다); 비오티닐화, 알렉사 플루오르 488-표지된 액틴 필라멘트; 1 μm 스트렙타비딘 비드; 산소 소거 시스템; ATP; 및 APB 버퍼. 유동 셀당 여러 개의 다발이 형성될 것이며, 위에서 설명한 액틴 농도는 원치 않는 상호 작용을 방지하기 위해 다발 사이에 적절한 간격을 제공합니다. 이는 또한 플로우 셀당 여러 힘 측정을 쉽게 획득하여 데이터 수집 효율성을 높일 수 있습니다. 힘 프로.......

토론

액틴 필라멘트와 상호 작용하는 미오신 앙상블의 역학을 조사하기 위해 형광 이미징과 결합된 광학 핀셋을 사용한 시험관 내 연구가 수행되었습니다. 악틴-미오신 - 액틴 다발은 근육 미오신 II, 번들의 하단 및 커버 슬립 표면의 로다민 액틴, 번들 상단의 488 표지 된 비오틴 액틴 필라멘트를 사용하여 조립되었습니다. 토끼 근육으로부터의 액틴 단백질은 일반 액틴 완충액 (GAB) 및 액틴 중합 완충액 (APB)을 사용하여 중합 및 안정화되었다. GAB 및 APB는 ATP, FC 버퍼 및 TC 버퍼를 사용하여 실험실에서 매일 새로 준비해야 합니다. 근육 미오신 II는 액틴-미오신 - 액틴 샌드위치를 형성하는데 사용되었다. Phalloidin은 액틴 필라멘트의 형광 염색 및 시험관 내 안정화에 사용되었습니다.

미오신 활성은 이전에 공개된^46,47과 같.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
액틴 단백질(비오틴): 골격근	세포골격	AB07-A	비오틴화 액틴 단백질
액틴 단백질, 토끼 골격근	세포골격	AKL99-A	액틴 단백질
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Actin 안정제 및 Alexa Fluor 488 염색
ATP	Fisher scientific	BP413-25	액틴에 필요 어셈블리 및 미오신 운동성
Beta-D-glucose	Fisher scientific	MP218069110	형광 이미징 중 광표백을 줄이는 데 사용되는 산소 제거 시스템의 일부
블로팅 등급 차단제(카제인)	Biorad	1706404	비특이적 결합으로부터 표면을 차단하는 데 사용
CaCl2	Fisher scientific	C79500	염화칼슘은 액틴 미오신 네트워크의 역학에 필요한 제어를 제공합니다
Catalase	Fisher scientific	ICN10040280	형광 이미징 중 광백화를 줄이는 데 사용되는 산소 제거 시스템의 일부
Coverslips	Fisher scientific	12544C	플로우 셀을 만드는 데 사용
DTT	Fisher 과학	AC327190010	완충액 준비
에 사용에탄올	Fisher scientific	A4094	Regent 커버 슬립 세척에 사용
포도당 산화 효소	Fisher scientific	34-538-610KU	형광 이미징 중 광 표백을 줄이는 데 사용되는 산소 제거 시스템의 일부
KCl	Fisher scientific	P217-500	버퍼 준비에 사용
KOH	Fisher scientific	P250-1	커버 슬립을 에칭하고 조정하는 데 사용됩니다. 완충액 pH MgCl
2	Fisher scientific	M33-500	완충액 준비에 사용
현미경 슬라이드	Fisher scientific	12-544-2	유동 세포를 만드는 데 사용
Myosin II 단백질: 토끼 골격근	세포골격	MY02	토끼 골격근에서 분리된 전체 길이 미오신 운동 단백질
Nanotracker2	Bruker/JPK	NT2	광학 포획 기구
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	유리 표면에 액틴 필라멘트의 접착
1 μ m	Spherotech	SVP-10-5	광학 트래핑 핸들
Tris-HCl	Fisher Scientific	PR H5121	완충액 준비에 사용

시설 커버 슬립 Rhodamine Phalloidin Cytoskeleton PHDR1 Actin 안정제 및 Rhodamine 형광 염색 Streptavidin 구슬의 ,