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방법 논문

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

1.6K 조회수

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DOI:

10.3791/63674

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2022년 6월 24일

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1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 3Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 및 다광자 현미경에 의한 수유 마우스 유선의 생체 내 이미징을 위한 손쉬운 기술을 설명합니다.

초록

유선은 조직 리모델링, 세포 극성 및 분비 메커니즘을 포함한 상피 기능을 조사하기 위한 탁월한 모델을 구성합니다. 임신 중에는 분비선이 뚱뚱한 패드에 박혀 있는 원시적인 유관 나무에서 초유와 우유의 형성과 분비를 위해 준비된 고도로 분지된 폐포 네트워크로 확장됩니다. 산후 분비샘은 막으로 코팅된 지질 방울(LD), 단백질, 탄수화물, 이온, 수분 등 신생아의 생존에 필요한 모든 영양소를 공급합니다. 유당, 카제인 미셀, 탈지유 단백질을 포함한 다양한 우유 성분이 폐포 세포 내에서 합성되고 정점 표면에서 엑소사이토시스(exocytosis)에 의해 소포에서 분비됩니다. LD는 거친 소포체의 합성 부위에서 세포 정점으로 운반되어 세포막으로 코팅되고 독특한 아포크린 메커니즘에 의해 분비됩니다. 항체 및 호르몬을 포함한 다른 미리 형성된 구성 요소는 transcytosis에 의해 상피의 장액 쪽에서 우유로 운반됩니다. 이러한 과정은 유선이 피부 분비샘이기 때문에 생체 내 현미경 검사가 가능하므로 실험적 조작에 직접 접근할 수 있습니다. 이 논문에서는 살아있는 마취된 마우스에서 실시간으로 LD 분비의 제자리 동역학을 조사하기 위한 간단한 절차를 설명합니다. 붕소-디피로메텐(BODIPY)665/676 또는 모노단실펜탄은 세포질에서 용해성 EGFP(enhanced green fluorescent protein)를 발현하거나 EGFP 또는 tdTomato에 융합된 막 표적 펩타이드를 발현하는 형질전환 마우스의 중성 지질 분획을 라벨링하는 데 사용됩니다. 멤브레인 태그가 부착된 융합 단백질은 세포 표면의 마커 역할을 하며, 지질 염료는 LD를 0.7μm ≥ 분해합니다. 타임랩스 이미지는 표준 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 15-25μm 깊이까지 기록하거나 다광자 현미경으로 조직 깊숙한 곳에서 이미징할 수 있습니다. 유선은 수술 내내 약리학적 제제 또는 형광 염료로 목욕할 수 있으며, 필요에 따라 급성 실험 조작을 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

서론

생쥐 유선의 생체 내 현미경 검사는줄기세포의 기원 및 분화 1,2, 전이성 종양의 진행3,4,5, 유방 발달 및 침식에 걸친 유관 대식세포의 역할6을 포함한 모든 생물학적 현상을 분석하는 강력한 방법으로 점점 더 주목받고 있습니다. Intravital Subcellular Microscopy (ISMic)7의 개발을 통해 수유 중 막 통과 및 분비 메커니즘 8,9 및 근상피 세포 9,10의 옥시토신 매개 수축에 대한 연구가 확장되었습니다. 피부와 체벽 사이의 분비샘의 접근성을 활용하는 두 가지 주요 방법이 개발되었습니다.

첫 번째 접근 방식에서는 아크릴 또는 유리 창을 피부에 삽입하고 금속 고정 링(1,3,11)으로 고정합니다. 생쥐는 수술을 잘 견디며, 몇 주에 걸쳐 동일한 동물에서 다양한 현상을 간헐적으로 분석할 수 있습니다. 이 방법은계통 추적 1,12 및 유방 종양의 침습 및 진행 모니터링에 특히 유용한 것으로 입증되었습니다 3,11. 그러나 전체 세포 수준 이하의 해상도는 어려운 것으로 입증되었는데, 그 이유는 분비선이 여전히 체벽에 붙어 있기 때문에 호흡과 심장 박동으로 인한 운동 인공물의 영향을 받기 때문입니다.

두 번째 접근법에서, 동맥은 혈관 구조가 손상되지 않은 피부 플랩에 외과적으로 노출되고 스페이서 4,9,13을 사용하여 현미경 스테이지에서 안정화됩니다. 따라서 분비샘의 일부가 복벽에서 효과적으로 분리되고 움직임 아티팩트가 최소화됩니다. 대부분의 경우 노출된 실질은 도립 현미경에서 마우스의 복부 쪽이 아래로 향하게 하여 커버슬립에 직접 배치됩니다. 최근의 수정에서, 마우스는 정립 현미경에 누운 상태로 놓고, 노출된 분비선은 커버슬립2로 밀봉된 액체로 채워진 세포에서 보호되었다. 이 후자의 구성을 사용하면 이미징 중 실험적 조작을 위해 실질 표면에 액세스할 수 있습니다. 두 경우 모두 <1 μm까지의 분해능으로 세포 내 과정을 분석할 수 있으며, 이는 유방 상피 세포에서 지질 방울(LD)을 추적하는 데 도움이 됩니다9.

본 프로토콜은 수유 중 LD의 생체 발생, 수송 및 분비를 예로 들어 세포 내 수준에서 유방 상피 세포의 생체 내 이미징을 위한 용이한 방법을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 우유 단백질14의 수송 및 분비, 상피의 장액 쪽에서 폐포 내강(alveolar lunmen)15,16으로의 단백질의 transcytosis, 및 involution17,18 동안의 분비샘의 리모델링을 포함한 많은 다른 과정에 널리 적용할 수 있다.

형광 단백질을 발현하는 마우스는 이미징을 위한 적절한 영역의 선택을 용이하게 하고 형태학적 참조 마커로 대부분의 생체 내 실험에 선호됩니다. 다양한 종류의 적합한 형질전환 및 knock-in 마우스가 이용 가능하며, 이들은 세포 구획, 세포골격 요소, 막 및 세포소기관에서 형광 단백질 마커를 발현한다19. 주어진 예에서는, 대부분의 세포(20)(EGFPcyto로 표시)에서 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)이 표적화된 EGFPcyto FvB 마우스와 tdTomato 및 EGFP 유전자를 암호화하는 이중 형광 Cre 라인인 C57BL/6J Tomato(mT/mG) 마우스(21)가 사용되었다. EGFP 발현은 tdTomato 유전자의 Cre 매개 절제를 통해 가능합니다. 어느 형광단이든 MARCKS 단백질21에서 유래한 시퀀을 통해 대부분의 세포에서 원형질막을 표적으로 합니다. 본 연구에서는 적색 tdTomato 형광단을 발현하는 마우스를 tdTomatomebr(mT)이라고 표시하고, tdTomato 유전자를 절제한 후 EGFP를 발현하는 마우스를 EGFPmembr(mG)로 표시한다.

생쥐는 복부 정중선의 양쪽에 5쌍의 유선, 흉부 영역(1-3번)에 3개, 사타구니 영역(4-5번)에 2쌍의 유선이 있습니다(그림 1A). ISMic의 경우, 서혜부는 흉부의 호흡 및 심장 박동과 관련된 전체적인 움직임에서 가장 멀리 떨어져 있기 때문에 가장 접근하기 쉽고 안정화가 가장 쉽습니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 미국 국립암연구소(National Cancer Institute), 국립보건원(National Institutes of Health)의 암연구센터(Center for Cancer Research), 국립암연구소(National Cancer Institute), 국립보건원(National Institutes of Health)의 기관동물보호및사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며, 이는 미국 국립연구위원회(National Research Council)의 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals), 미국 공중보건국(US Public Health Service)의 실험동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 정책(Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 이루어졌다. 및 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드. 이 연구를 위해 암컷 원시 마우스(생후 4-5개월, 수유 10일째)의 4번 분비샘을 오른쪽 누운 자세에서 외과적으로 준비했습니다(그림 1A).

1. 동물 준비

  1. 필요한 마취제의 양을 계산하기 위해 상단 로딩 저울에서 마우스의 무게를 잰다.
  2. 마취제를 바르는 동안과 도운 후에는 마우스를 보온 패드에 올려 놓아 체온을 유지하십시오.
  3. 산소 포화 호흡실( 재료 표 참조) 에서 이소플루란(3.0%-3.5%)에 1-2분 동안 잠시 노출시켜 마우스를 마취한 다음 100mg/kg의 케타민과 10mg/kg의 자일라진 혼합물을 복강내 주사합니다.
  4. 필요에 따라 45분 정도마다 유치 카테터(단계 3.4 참조)를 통해 자일라진과 케타민의 적정 용량(1.3단계에서 설명한 초기 용량의 절반에서 1/4)을 추가로 적용하여 수술 및 이미징 중에 동물을 깊은 마취 상태로 유지합니다.
    참고: 최적의 마취 평면은 10-20분마다 구개와 발가락 꼬집 반사를 확인하는 것으로 가장 쉽게 유지할 수 있습니다. 의식이 있는 쥐의 온도는 36.5-38 °C이며 마취 시 34.5 °C로 떨어집니다.
  5. 유사한 수유 단계에 있는 기증자 마우스가 이용 가능한 경우, 새끼22 를 교차 양육하는 단계; 그렇지 않으면 깔짚을 안락사시키십시오.
    참고: 생후 10일< 된 새끼는 3.0% 이소플루란에 노출시킨 후 목을 베어 안락사시켜야 합니다. 생후 10일≥ 된 새끼는 CO2 흡입 후 자궁 경부 탈구를 통해 안락사시켜야 합니다.

2. 수술 절차

  1. 수술 내내 보온 패드에서 마우스를 따뜻하게 유지하십시오. 휴대용 전기 면도기를 사용하여 4번과 5번 유선(supine, right)을 둘러싼 피부의 털을 면도합니다. 베타딘과 알코올 스크럽을 번갈아 가며 3회 사용하여 면도 부위를 청소합니다.
  2. 모든 수술 기구를 70% 알코올로 닦으십시오. 핀셋으로 피부를 끼어 융기된 피부를 날카로운 가위로 잘라 네 번째 젖꼭지에 가까운 정중선을 절개합니다. 분비샘 주위를 두개골과 꼬리 방향으로 원을 그리며 절개하고 복부에서 피부를 조심스럽게 벗겨냅니다. 노출된 피부를 생리식염수로 촉촉하게 유지하십시오.
  3. 출혈을 최소화하려면 혈관을 절단하기 전에 휴대용 소작기( 재료 표 참조)로 눈에 띄는 혈관을 밀봉하십시오. 모든 외인성 혈액은 이후에 광학 해상도가 손실되는 것을 방지하기 위해 생리식염수로 즉시 제거해야 합니다.
  4. 미세한 집게로 표층을 부드럽게 놀려 표재성 결합 조직과 지방 조직을 제거합니다.
  5. 노출된 분비샘을 생리식염수로 촉촉하게 유지하고 젤과 반투명하고 유연한 열가소성 필름으로 복벽을 보호하십시오( 재료 표 참조).
    참고: 2.2-2.5단계는 분비샘 부분과 관련 혈관이 복벽에서 분리된 피부 플랩을 만듭니다(그림 1Bi-iv).
  6. 필요한 경우, 수술 중 노출된 분비샘을 목욕시켜 외인성 제제(예: 약리제) 또는 세포소기관 특이적 염료로 분비샘을 치료합니다.
    참고: 주어진 예에서, EGFPcyto 또는 EGFPmembr (mG) 마우스의 LD는 1.0mL의 붕소-디피로메텐(BODIPY)665/676 (식염수에 1에서 1,000배로 희석된 디메틸 설폭사이드에 10mM 원액을 넣고 <1시간 동안 적용)으로 라벨링하고, tdTomatomembr (mt) 또는 EGFPmembr (mG) 마우스에서 라벨링했습니다. 0.5 mL의 모노단실펜탄23 (디메틸 설폭사이드에 0.1M 원액을 식염수에 1 내지 1,000배로 희석하고 5분 동안 적용).

3. 이미징 준비

  1. 가열된(37°C) 도립 현미경 스테이지에 복부 쪽이 아래로 향하게 하여 마우스 플랩이 중앙 커버 유리(30mm) 위로 확장되도록 합니다(그림 1Biv). 얇은 젤 층으로 노출 된 부분을 보호하십시오.
  2. 맞춤형 스페이서로 피부 플랩을 안정화하여 호흡과 심장 박동으로 인한 움직임 아티팩트로부터 샘을 완충합니다. 이를 위해 피부 플랩과 몸체 벽 사이에 3개의 테이프로 감싼 면 막대기(그림 1Ci)로 만든 노치가 있는 스페이서를 놓고 뒷다리와 꼬리를 테이프로 테이프로 스페이서 뒤의 스테이지에 연결합니다(그림 1Bv).
  3. 스테이지 오프닝(그림 1Bv)의 양쪽 끝에 있는 플라스틱 커버(그림 1Cii)를 단단히 테이프로 감아 이미징 중에 피부 피판이 미끄러지는 것을 방지합니다.
  4. 튜브, 주사기 및 펌프에 부착된 등쪽 피부 아래에 피하 유치 카테터를 삽입합니다( 재료 표 참조).
  5. 기존 형광 현미경으로 피부 피판이 적절한 혈류로 안정적인지 확인합니다(그림 1Bvi).
  6. 이미징 중에 따뜻하게 유지하기 위해 마우스를 스폰지 거즈( 재료 표 참조)로 덮으십시오.
    참고: 3.1-3.5단계는 정량 분석에 적합한 고해상도 비디오를 획득하는 데 가장 중요합니다. 조직 안정성이 확인되지 않는 한 이 단계를 넘어 진행하는 것은 의미가 없습니다.

4. 현미경 검사

  1. BODIPY665/676(그림 2, 비디오 1 및 비디오 2)으로 표지된 EGFPcyto 또는 EGFPmembr(mG) 마우스의 기존 컨포칼 현미경 검사의 경우 37°C에서 유지되는 예열된 60x 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 도립 현미경을 사용하십시오(재료 표 참조).
    1. 각각 488 및 633 레이저를 사용하여 EGFP 및 BODIPY665/676 을 별도로 검출합니다. EGFP, 여기 488 nm 및 방출 560 nm용, 대역 통과 필터 BA 505-605 포함; BODIPY665/676용, 여기 633nm 및 방출 668nm, 대역 통과 필터 BA 655-755 포함.
    2. 라인 스캔을 통해 1-2시간 동안 5초 또는 10초마다 4 또는 8 μs/픽셀(512 x 512 픽셀, 픽셀당 12비트)로 이미지를 수집하고 TIFF 파일로 저장합니다. 이미징 주기 전반에 걸쳐 x/y 드리프트를 수정하여 프레임 내에서 스캔된 영역을 수동으로 유지합니다. 현미경과 연결된 소프트웨어를 사용하여 z-스캔에서 3D 이미지를 구성합니다( 재료 표 참조).
  2. monodansylpentane(그림 3, 비디오 3)으로 표지된 EGFPmembr(mG) 마우스의 이광자 현미경 검사에는 조정 가능한 레이저와 37°C로 예열된 30x 대물렌즈가 장착된 도립 현미경을 사용하십시오(재료 표 참조).
    1. 910nm에서 글랜드를 여기시키고 청색 및 녹색 방출에 대해 각각 410-460nm 및 495-540nm 대역 통과 필터를 사용하여 두 개의 GaAs 검출기로 모노단실펜탄 및 EGFP를 검출합니다.
    2. 2μs/픽셀(320 x 320 픽셀, 픽셀당 16비트)의 라인 스캔으로 이미지를 수집하고 OIR 파일로 저장합니다. 이미징 주기 전반에 걸쳐 x/y 드리프트를 수정하여 프레임 내에서 스캔된 영역을 수동으로 유지합니다. 현미경과 연결된 소프트웨어를 사용하여 z-스캔에서 3D 이미지를 구성합니다.
  3. monodansylpentane(그림 4, 비디오 4)으로 라벨링된 tdTomatomembr(mT) 마우스의 이광자 현미경 검사에는 조정 가능한 레이저가 있는 도립 현미경과 37°C로 예열된 63x 대물렌즈(재료 표 참조)를 사용합니다.
    1. 800 nm와 1,060 nm에서 동시에 표본을 여기시키고 방출 418-471 nm에서 설정된 HyD 하이브리드 검출기로 모노단실펜탄을 검출하고 방출 595-667 nm에서 설정된 다른 HyD 하이브리드 검출기로 TdTomato를 검출합니다.
    2. 200Hz(512 x 512 픽셀, 픽셀당 12비트)에서 평균을 내는 4개의 라인으로 라인 스캔으로 이미지를 수집하고 LIF 파일로 저장합니다. 이미징 주기 전반에 걸쳐 x/y 드리프트를 수정하여 프레임 내에서 스캔된 영역을 수동으로 유지합니다. 현미경과 연결된 소프트웨어를 사용하여 z 스캔에서 3D 이미지를 구성합니다.

5. 안락사

  1. 기관에서 승인한 프로토콜에 따라CO2 흡입을 통해 이미징이 끝나면 마우스를 안락사시킵니다.

6. 실시간 동영상 제작

  1. 시간 시퀀스를 TIFF 파일로 변환한 다음 적절한 소프트웨어를 사용하여 비디오로 변환합니다( 자료 표 참조).
    참고: 특정 비디오에 대한 정량적 분석은 이 문서의 범위를 벗어나며 특정 문제를 해결하기 위한 특정 방법이 필요합니다. 예를 들어, 타액선에서 타액의 세포분리작용에서 방선근 복합체의 역할에 대해서는 Ebrahim et al.24 , 간에서 담즙 분비의 역학에 대해서는 Meyer et al.25 , 유방 상피 세포에서 LD 분비 분석에 대해서는 Masedunskas et al.9 를 참조하십시오.

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결과

우유는 분극화된 폐포 상피 세포에서 분비되며, 이 세포는 임신 중에 광범위한 유관 나무(26)의 새싹과 분화한다(그림 2A). 우유 합성을 위한 전구체는 기저막/외막에 걸쳐 동화되고 완성품은 정점 표면을 가로질러 중앙 "우유 공간"으로 분비됩니다. 각 폐포의 기저 쪽은 근상피 세포의 성상 배열로 덮여 있으며(그림 2A), 이 세포는 기저막(그림 2A에 표시되지 않음)에 의해 장막 쪽에서 보호됩니다. 옥시토신에 의해 유도된 근피피의 수축은 분비 세포(9,27)에서 LD를 방출하고 완성된 우유 산물을 유관(ductular tree)을 통해 젖꼭지와 젖먹이 신생아(10)로 강제한다. 땀샘...

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토론

단광자 현미경 또는 다광자 현미경을 사용할지 여부는 묻는 질문, 이미징할 조직의 특성과 위치, 필요한 해상도에 따라 달라집니다. 다광자 현미경은 근적외선에서 두 개 이상의 저에너지 광자를 생성하는 것을 기반으로 하며, 이는 단광자 현미경보다 더 적은 광독성으로 더 깊은 깊이로 조직을 관통할 수 있습니다(29,30). 또한 형광단은 초점에서만 여기되어 주변 조직에서 빛의 산란을 줄입니다. 따라서 다광자 현미경 검사는 세포 계통의 전체 유선 내에서 1,2,12, 종양 전이의 진행 3,13 및 다세포 상호 작용2...

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공개 사항

저자 중 누구도 선언할 상충되는 이해관계가 없습니다.

감사의 글

저자는 동물 관리 및 보살핌을 제공한 Sherry Rausch와 Samri Gebre(National Cancer Institute, NIH)와 다양한 플라스틱 스페이서를 생산하는 데 도움을 준 James Mather에게 감사를 표합니다. 이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
488 레이저Melles-Griot-CW  레이저 50 mW
60x PLAPON 오일 이멀젼 대물렌즈 (NA 1.42)Olympus1-U2B933렌즈 컨포칼 현미경
633 레이저Melles-Griot-CWHe-Ne 레이저 12 mW
63x 대물렌즈 (NA 1.40, HC PL APO CS2)Leica11506350렌즈 2광자 현미경
BA 410-460 nm크로마-대역 통과 필터
BA 495-540 nm크로마대역 통과 필터
BA 505-605 nm크로마대역 통과 필터
BA 655-755 nm채도대역 통과 필터
붕소 디피로메탄(BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932지질 과산화 센서
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651젤
카테터테루모SV27EL날개 달린 주입 세트 
소작기 Braintree Scientific, IncGEM 5917소작 시스템
CMV-Cre 마우스 잭슨 랩006054마우스 라인
CoverslipBioptechs-30mm직경 커버 립 도립
큐리티 4x4 인치 다목적 스폰지 거즈Covidien9024스폰지
EGFPcyto 마우스잭슨 랩003291마우스 라인
피지/ImageJ 소프트웨어오픈 소스무료소프트웨어 도구
미세 집게Braintree Scientific, IncFC003 8조직 집게
Fluoview 1000 현미경OlympusFV1000컨포칼 현미경
FluoView 소프트웨어Olympus-Confocal현미경 및 Two-photon 현미경
휴대용 전기 면도기Braintree Scientific, IncCLP-8786-451A무선 클리퍼
열 패드Braintree Scientific, IncDPIP동물용 열 패드
HyD 감지기Leica-Leica4Tune 스펙트럼 감지기
Imaris 소프트웨어Bitplane / Oxford Instruments-상용 소프트웨어 도구
Ingisht X3 조정 가능한 레이저스펙트럼 물리학통찰력 X3조정 가능한 펄스 - 레이저
IsofluraneVetOne13985-046-40마취
케타민 VetOne13985-702-10마취
LAS X 소프트웨어microscope 소프트웨어 도구
Mai-Tai 조정 가능한 레이저스펙트럼 물리학Mai-Tai레이저
MetaMorph분자 장치-상용 소프트웨어 도구
Monodansylpentane AUTODOTAbceptaSm1000a지질 방울 염료
MPE-RS 현미경OlympusIX70이광자 현미경
mT/mG 마우스Jackson lab007676Mouse line
Objective heaterBioptechs150819confocal 및 two-photon microscope 모두를 위한 Objective heater
산소 포화 호흡 챔버Patterson Scientific78933385, SAS3 및 EVAC4가스 마취 및 배출 시스템 
ParafilmHeathrow ScientificHS234526B반투명, 유연, 열가소성 필름
PMT 검출기Olympus-Descanned    검출기
PMT 검출기LSM-Technology맞춤형비스캔 검출기
펌프Harvard Apparatus703602, 704402Nanomite injector and controller
SalineQuality Biological114-055-721EANormal Saline
Sharp blunt-ended scissorsBraintree Scientific, IncSCT-S 508Surgical scissors
주사기Covidien22-257-1501mL 투베르쿨린 주사기
TCS SP8 다이브 스펙트럼 현미경LeicaSP8투포톤 현미경
핀셋 Braintree Scientific, IncFC032조직 집게
자일라진 VetOne13985-704-10마취
현미경 제 Leica-Two-photon 제

참고문헌

  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  2. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2011).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nature Reviews Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nature Cell Biology. 22 (5), 546-558 (2020).
  7. Ebrahim, S., Weigert, R. Intravital microscopy in mammalian multicellular organisms. Current Opinion in Cell Biology. 59, 97-103 (2019).
  8. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Advances in Intravital Microscopy. Weigert, R. , Weigert) Springer-Verlag. Netherlands. 187-204 (2014).
  9. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  10. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally-mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  11. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  12. Zomer, A., et al. Brief report: Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  13. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  14. Burgoyne, R. D., Duncan, J. S. Secretion of milk proteins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 275-286 (1998).
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