CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 뇌 제거를 결합하면 많은 수의 뉴런과 성상세포를 동시에 조사할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 조직 제거를 결합하면 여러 유형의 뇌 세포와 그 상호 작용을 동시에 조사 할 수 있습니다. 바이러스 벡터 형질도입은 동일한 조직 내에서 상이한 형광 색상으로 다양한 세포 유형의 마킹을 가능하게 한다. 세포는 활성 또는 돌출에 의해 유전적으로 확인될 수 있다. 변형된 CLARITY 프로토콜을 사용하여, 성상세포 및 뉴런의 잠재적 표본 크기는 2-3배 정도 성장하였다. CLARITY의 사용은 조각에 전체적으로 들어가기에는 너무 큰 완전한 성상 세포의 이미징과 모든 과정으로 소마타를 검사 할 수있게합니다. 또한, 성상세포와 상이한 뉴런 세포 유형 사이의 공간적 상호작용, 즉 각 성상세포 도메인에서 피라미드형 뉴런의 수 또는 성상세포와 특정 억제 뉴런 집단 사이의 근접성을 조사할 수 있는 기회를 제공한다. 이 백서에서는 이러한 방법을 어떻게 적용해야 하는지 자세히 설명합니다.
서론
최근 몇 년 동안, 성상 세포 기능에 대한 지식과 그들이 신경 회로와 상호 작용하는 방법이 극적으로 증가했습니다. 성상세포는 가소성1,2에 영향을 미치고, 신경 손상 후 회복을 돕고, 3,4를 돕고, 심지어 드노보 뉴런 강화를 유도할 수 있으며, 최근 연구들은 기억 획득 및 보상에서 성상세포의 중요성을 보여주었으며, 이전에는 순전히 신경 기능으로 간주되었다 5,6,7 . 성상세포 연구에 특히 관심을 갖는 특징은 해마 및 기타 뇌 구조8,9,10에서 독특한 공간 조직을 유지하는 세포의 공간 배열입니다. 세포 소마타 사이에 얽혀있는 뉴런 수상 돌기와는 달리, 해마 성상 세포는 시각적으로 구별 가능한 영역에 서식하며 과정 사이에 약간의 겹....
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프로토콜
실험 프로토콜은 히브리 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건 연구소 가이드의 지침을 충족했습니다.
1. 바이러스 벡터 형질도입
참고: 바이러스 벡터 형질도입은 뇌에서 형광단을 발현하는 데 사용됩니다.
- 아틀라스 (예 : Allen Brain Atlas)를 사용하여 대상 영역의 관련 조정을 찾으십시오.
참고: 3D 아틀라스는 온라인에서 찾을 수 있습니다(예: http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - 입체 수술을 사용하여 바이러스 벡터를 관련 뇌 구조에 주입하십시오. 자세한 프로토콜은 9 를 참조하십시오.
- 형광단 발현을 위해 3-6 주 동안 기다리십시오.
참고 : 세포체 만 표시해야하는 경우 짧은 시간이면 충분합니다. 축삭 투영이 문제와 관련이 있다면 형광단이 축삭으로 표현되는 데 더 오래 걸리기 때문에 오랜 시간이 필요할 것입니다.이 길이는 수 밀리미터 일 수 있습니다. - 형광단 발현(바이러스 발현 및 TG 동물 둘 다)의 특이성 및 침투성을 미리 검....
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결과
두꺼운 뇌 조직 조각을 성공적으로 제거하면 단일 세포 또는 이웃 세포 그룹의 특성과는 달리 큰 세포 집단의 특성에 관해 질문 할 수있는 새로운 범위의 질문이 생깁니다. 성공적인 결과를 얻기 위해서는 샘플 간의 분산을 줄이기 위해 고려해야 할 광범위한 매개 변수 (예 : 선명도, 형광 정보, 팽윤도 매개 변수)가 있으므로 CLARITY 프로토콜을 엄격하게 준수해야합니다.
도 1은 클리어링 방법의 모든 단계를 통한 형광 단백질 발현 검증으로부터의 전체 클리어링 과정을 설명한다. 도 2는 이 광자 또는 공초점 현미경 하에서 이미징에 최적으로 정화된 조직을 위한 챔버를 제조하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜에 필요한 재료는 챔버 준비의 다른 프로토콜에 비해 매우 저렴합니다.
도 3
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토론
조직 제거 방법은 뇌 연구에서 혁신적인 도구를 제시하여 이전에는 질문 할 수 없었던 질문을 초대합니다. 작은 세포 그룹, 단일 세포 또는 심지어 단일 시냅스의 특성을 표적화하는 것으로부터, CLARITY는 이제 관련 형광단을 사용하여 전체 세포 집단 또는 장거리 연결 특징의 표적화를 가능하게 한다.
형광단 발현 및 CLARITY 절차 조합의 결과는 바이너리가 아니며; 많은 요인들이 차선책의 결과로 이어지는 절차를 방해 할 수 있습니다. 첫째, 형광단 발현은 사전에 검증되어야 한다. CLARITY 절차가 일부 정보 손실을 야기하기 때문에, 충분한 형광단 단백질 발현은 CLARITY 프로세스의 끝에서 이미지의 유효성에 결정적이다. 둘째, 혈액의 자동 형광은 두꺼운 조각에서 신뢰할 수없는 데이터로 이어질 수 있기 때문에 모든 혈액이 뇌에서 빠져 나오도록주의 깊게 다루어야합니다. 셋째, 프로토콜에서 논의된 모든 파라미터는 클리어링 공정의 각 단계에서 정밀하게 처리되어야 하며, 예를 들어.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램 (보조금 계약 No 803589), 이스라엘 과학 재단 (ISF 보조금 번호 1815/18) 및 캐나다 - 이스라엘 보조금 (CIHR-ISF, 보조금 번호 2591/18)에 따라 유럽 연구위원회 (ERC)로부터 자금을 지원받았습니다. 전체 원고에 대해 의견을 주신 Nechama Novick에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | 성상교세포를 검출하는 데 사용되는 바이러스 벡터 | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | 뉴런을 검출하는 데 사용되는 바이러스 벡터 | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | 뉴런 핵을 검출하는 데 사용되는 바이러스 벡터 | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (증권 시세 표시기) | 뉴런 검출에 사용되는 바이러스 벡터 | |
| 아크릴아미드(40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| 비사크릴아미드(2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| 붕산 | 시그마 | #B7901 | 분자량 - 61.83g/mol |
| 컨포칼 현미경, 스캐닝, FV1000 | Olympus | 4x 대물렌즈(UPlanSApo, 0.16NA) | |
| Imaris 소프트웨어 | Bitplane, UK | 이미지의 3D 분석을 허용하는 소프트웨어 | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SyGlass 소프트웨어 | 가상 현실을 사용하여 이미지의 3D 분석을 허용하는 소프트웨어 | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | 분자량 - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| 2광자 현미경 | Neurolabware | Ti:사파이어 레이저(Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP 광전자 증배관(Hamamatsu, H10770-40), 대역통과 필터(Semrock), 침수 16x 대물렌즈(Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 이니시에이터 | 와코 | #011-19365 |
참고문헌
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
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