이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
다양한 전장 바이러스 변이체의 반복 생성을 위한 편리한 방법이 없기 때문에 RNA 바이러스의 유도 진화 연구가 방해를 받고 있습니다. 전체 RNA 게놈 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 통합함으로써 무작위 게놈 전체 치환 돌연변이 유발을 유도할 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 다양한 라이브러리를 합성하여 관심 표현형을 가진 바이러스 돌연변이를 식별하는 방법을 개발했습니다. 전장 돌연변이 RNA 합성(FL-MRS)이라고 하는 이 방법은 다음과 같은 이점을 제공합니다: (i) 매우 효율적인 원스텝 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 통해 대규모 라이브러리를 생성할 수 있는 능력; (ii) DNA 중합효소의 충실도를 조작하여 다양한 수준의 유전적 다양성을 가진 라이브러리 그룹을 만드는 능력; (iii) 돌연변이 RNA 합성을 위한 주형으로서 직접 작용할 수 있는 전장 PCR 산물의 생성; (iv) 원하는 표현형의 바이러스 돌연변이를 스크리닝하기 위해 선택되지 않은 입력 풀로 숙주 세포에 전달될 수 있는 RNA를 생성하는 능력. 우리는 역유전학 접근법을 사용하여 FL-MRS가 C형 간염 바이러스인 JFH1 분리물의 수명 주기의 모든 단계에서 바이러스 지향 진화를 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구라는 것을 발견했습니다. 이 기술은 양성 RNA 바이러스의 발병 기전 및 항바이러스 내성에서 바이러스 유전자의 적응, 복제 및 역할을 이해하기 위해 유도 진화를 사용하는 데 매우 유용한 도구인 것으로 보입니다.
서론
전방 유전자 스크리닝은 관심 있는 바이러스 표현형으로 시작한 다음 게놈의 염기서열을 분석하고 원래 균주의 표현형과 비교하여 해당 표현형을 유발하는 돌연변이를 식별하려고 시도합니다. 대조적으로, 역 유전자 스크리닝에서는 표적 유전자에 무작위 돌연변이가 도입된 후 결과 표현형을 검사합니다1. 역유전학 접근법의 경우, 시험관 내 돌연변이 유발은 관심 표현형을 연속적으로 스크리닝하는 변이체 풀을 만드는 데 가장 널리 사용되는 기술입니다. 오류가 발생하기 쉬운 PCR(ep-PCR)2,3, 원형 중합효소 확장4 및 Mu-transposon 삽입 돌연변이 유발 5,6,7을 포함하여 RNA 바이러스의 게놈 전체 무작위 돌연변이 유발을 달성하기 위한 다양한 유전 도구가 보고되었습니다. 후자의 두 가지 방법은 제한된 염기서열 다양성을 가진 라이브러리를 생성하고 바이러스에 매우 치명적이며 감염성 바이러스 변이체의 회복을 심각하게 제한하는 대....
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프로토콜
참고: 여기에 사용된 JFH1 균주(WT)는 국립 전염병 연구소의 와키타 타카지 씨가 친절하게 선물한 것입니다. 인간 간종 세포주(Huh7.5)는 록펠러 대학의 찰스 라이스(Charles Rice)가 선물한 것입니다. 이 방법의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 이용한 JFH1의 게놈 전체 치환 돌연변이 유발
- ep-PCR을 수행하려면 pJFH1 주형(JFH1 균주에서 분리된 플라스미드)이 없는 표 1에 설명된 반응 성분과 함께 프라이머 J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' 및 J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3'(그림 1A)을 사용하여 4세트의 실험을 위한 마스터 믹스를 준비합니다.
- 마스터 혼합물을 4개의 튜브에 분취하고, 100ng, 50ng, 25ng 및 10ng의 템플릿을 개별 튜브에 추가하고, 반응의 총 부피를 50μL로 조정합니다. 표 2에 설명된 순환 조건을 적용하여 T7 ....
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결과
그림 1에 설명된 절차에 따라 다양한 전장 HCV 변이체를 생성하고 관심 약물 내성 표현형을 스크리닝할 수 있습니다. 전체 게놈 돌연변이 라이브러리는 그림 2와 같이 감소량(100-10ng)으로 clonal-pJFH1을 사용하여 합성되었습니다. ep-PCR 산물(돌연변이 라이브러리)의 평균 수율은 3.8-12.5ng/μL 범위였습니다. 그림 3은 클론-pJFH1 및 대표적인 돌연변이 라이브러리(클론-pJFH1 50ng를 사용하여 합성된 ML50)에서 합성된 바이러스 전사체를 보여줍니다. clonal-pJFH1은 XbaI 분해를 통해 선형화되었고, ML50은 시험관 내 전사 반응에 직접 사용되었습니다. 그림 4와 같이 ep-PCR 반응에서 입력 pJFH1이 감소함에 따라 돌연변이 라이브러.......
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토론
이 연구에서는 HCV 전체 게놈 라이브러리를 합성하기 위해 ep-PCR18 과 역 유전학을 통합하는 간단하고 빠른 FL-MRS 절차를 자세히 설명했으며, 이는 세포 배양 시스템에서 약물 내성 표현형 스크리닝을 위한 복제 가능한 변이체를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 저충실도 Taq DNA 중합효소의 사용은 전체 길이 바이러스 게놈의 PCR 증폭 중에 치환을 통합할 수 있는 ep-PCR의 전제 조건입니다. 여러 저충실도 Taq DNA 중합효소를 테스트한 결과 Platinum Taq DNA 중합효소가 높은 수율로 ~10kb 크기의 ep-PCR 산물을 생성한다는 것을 발견했습니다(데이터는 표시되지 않음). 고정된 수의 열 주기를 사용하고 입력 템플릿 양을 변경하여 전체 게놈 라이브러리에서 돌연변이의 비율을 제어하는 것이 좋습니다. FL-MRS는 전체 길이 바이러스 RNA에 대한 템플릿으로 잘못된 전체 게놈을 사용하기 때문에, RNA 합성 반응이 정의된 길이의 바이러스 전사체를 생성하도록 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구에 대한 자금 지원(보조금 번호 BT/PR10906/MED/29/860/2014)은 인도 정부 생명공학부에서 제공했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1kb 플러스 DNA 사다리 | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml 원심분리기 튜브 | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml 원심분리기 튜브 | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm 세포 배양 접시 | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml 원심분리기 튜브 | Tarsons | 546041 | |
| 아세트산 | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose 젤 전기영동 유닛 | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| 소 혈청 알부민 | HiMedia | MB083 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템 | BioRad | 1855201 | |
| 클로닝 플레이트 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 인큐베이터 | New Brunswick | Galaxy 170R | |
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| 데옥시뉴클레오티드 (dNTP) 솔루션 세트 | NEB | N0446 | |
| 디에틸 피로카보네이트 (DEPC) | SRL 화학 물질 | 46791 | |
| 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM 고 포도당 | Lonza | BE12-604F | |
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| 마이크로 팁 10 - 100 &마이크로; 엘 | Tarsons | 521010 | |
| 마이크로 팁 200-1000 &마이크로; 엘 | Tarsons | 521020 | |
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| Trypsin-EDTA 솔루션 | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| 진공 집중기 | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| 수조 | 그랜트 | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
참고문헌
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of ....
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재인쇄 및 허가
