양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

Summary

이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.

Abstract

다양한 전장 바이러스 변이체의 반복 생성을 위한 편리한 방법이 없기 때문에 RNA 바이러스의 유도 진화 연구가 방해를 받고 있습니다. 전체 RNA 게놈 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 통합함으로써 무작위 게놈 전체 치환 돌연변이 유발을 유도할 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 다양한 라이브러리를 합성하여 관심 표현형을 가진 바이러스 돌연변이를 식별하는 방법을 개발했습니다. 전장 돌연변이 RNA 합성(FL-MRS)이라고 하는 이 방법은 다음과 같은 이점을 제공합니다: (i) 매우 효율적인 원스텝 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 통해 대규모 라이브러리를 생성할 수 있는 능력; (ii) DNA 중합효소의 충실도를 조작하여 다양한 수준의 유전적 다양성을 가진 라이브러리 그룹을 만드는 능력; (iii) 돌연변이 RNA 합성을 위한 주형으로서 직접 작용할 수 있는 전장 PCR 산물의 생성; (iv) 원하는 표현형의 바이러스 돌연변이를 스크리닝하기 위해 선택되지 않은 입력 풀로 숙주 세포에 전달될 수 있는 RNA를 생성하는 능력. 우리는 역유전학 접근법을 사용하여 FL-MRS가 C형 간염 바이러스인 JFH1 분리물의 수명 주기의 모든 단계에서 바이러스 지향 진화를 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구라는 것을 발견했습니다. 이 기술은 양성 RNA 바이러스의 발병 기전 및 항바이러스 내성에서 바이러스 유전자의 적응, 복제 및 역할을 이해하기 위해 유도 진화를 사용하는 데 매우 유용한 도구인 것으로 보입니다.

Introduction

전방 유전자 스크리닝은 관심 있는 바이러스 표현형으로 시작한 다음 게놈의 염기서열을 분석하고 원래 균주의 표현형과 비교하여 해당 표현형을 유발하는 돌연변이를 식별하려고 시도합니다. 대조적으로, 역 유전자 스크리닝에서는 표적 유전자에 무작위 돌연변이가 도입된 후 결과 표현형을 검사^합니다1. 역유전학 접근법의 경우, 시험관 내 돌연변이 유발은 관심 표현형을 연속적으로 스크리닝하는 변이체 풀을 만드는 데 가장 널리 사용되는 기술입니다. 오류가 발생하기 쉬운 PCR(ep-PCR)^2,3, 원형 중합효소 확장⁴ 및 Mu-transposon 삽입 돌연변이 유발 5,6,7을 포함하여 RNA 바이러스의 게놈 전체 무작위 돌연변이 유발을 달성하기 위한 다양한 유전 도구가 보고되었습니다. 후자의 두 가지 방법은 제한된 염기서열 다양성을 가진 라이브러리를 생성하고 바이러스에 매우 치명적이며 감염성 바이러스 변이체의 회복을 심각하게 제한하는 대....

Protocol

참고: 여기에 사용된 JFH1 균주(WT)는 국립 전염병 연구소의 와키타 타카지 씨가 친절하게 선물한 것입니다. 인간 간종 세포주(Huh7.5)는 록펠러 대학의 찰스 라이스(Charles Rice)가 선물한 것입니다. 이 방법의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 이용한 JFH1의 게놈 전체 치환 돌연변이 유발

1. ep-PCR을 수행하려면 pJFH1 주형(JFH1 균주에서 분리된 플라스미드)이 없는 표 1에 설명된 반응 성분과 함께 프라이머 J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' 및 J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3'(그림 1A)을 사용하여 4세트의 실험을 위한 마스터 믹스를 준비합니다.
2. 마스터 혼합물을 4개의 튜브에 분취하고, 100ng, 50ng, 25ng 및 10ng의 템플릿을 개별 튜브에 추가하고, 반응의 총 부피를 50μL로 조정합니다. 표 2에 설명된 순환 조건을 적용하여 T7 ....

Results

그림 1에 설명된 절차에 따라 다양한 전장 HCV 변이체를 생성하고 관심 약물 내성 표현형을 스크리닝할 수 있습니다. 전체 게놈 돌연변이 라이브러리는 그림 2와 같이 감소량(100-10ng)으로 clonal-pJFH1을 사용하여 합성되었습니다. ep-PCR 산물(돌연변이 라이브러리)의 평균 수율은 3.8-12.5ng/μL 범위였습니다. 그림 3은 클론-pJFH1 및 대표적인 돌연변이 라이브러리(클론-pJFH1 50ng를 사용하여 합성된 ML50)에서 합성된 바이러스 전사체를 보여줍니다. clonal-pJFH1은 XbaI 분해를 통해 선형화되었고, ML50은 시험관 내 전사 반응에 직접 사용되었습니다. 그림 4와 같이 ep-PCR 반응에서 입력 pJFH1이 감소함에 따라 돌연변이 라이브러.......

Discussion

이 연구에서는 HCV 전체 게놈 라이브러리를 합성하기 위해 ep-PCR¹⁸ 과 역 유전학을 통합하는 간단하고 빠른 FL-MRS 절차를 자세히 설명했으며, 이는 세포 배양 시스템에서 약물 내성 표현형 스크리닝을 위한 복제 가능한 변이체를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 저충실도 Taq DNA 중합효소의 사용은 전체 길이 바이러스 게놈의 PCR 증폭 중에 치환을 통합할 수 있는 ep-PCR의 전제 조건입니다. 여러 저충실도 Taq DNA 중합효소를 테스트한 결과 Platinum Taq DNA 중합효소가 높은 수율로 ~10kb 크기의 ep-PCR 산물을 생성한다는 것을 발견했습니다(데이터는 표시되지 않음). 고정된 수의 열 주기를 사용하고 입력 템플릿 양을 변경하여 전체 게놈 라이브러리에서 돌연변이의 비율을 제어하는 것이 좋습니다. FL-MRS는 전체 길이 바이러스 RNA에 대한 템플릿으로 잘못된 전체 게놈을 사용하기 때문에, RNA 합성 반응이 정의된 길이의 바이러스 전사체를 생성하도록 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1kb 플러스 DNA 사다리	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml 원심분리기 튜브	Tarsons	500010
15 ml 원심분리기 튜브	Tarsons	546021
35 mm 세포 배양 접시	Tarsons	960010
50 ml 원심분리기 튜브	Tarsons	546041
아세트산	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose 젤 전기영동 유닛	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
소 혈청 알부민	HiMedia	MB083
원심분리기	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템	BioRad	1855201
클로닝 플레이트 90 mm	Tarson	460091
CO2 인큐베이터	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri 마이크로볼륨 분광계	Titertek-Berthold	11050140
DAB  기판  키트	Abcam	ab94665
dATP 솔루션	NEB	N0440S
데옥시뉴클레오티드 (dNTP) 솔루션 세트	NEB	N0446
디에틸 피로카보네이트 (DEPC)	SRL 화학 물질	46791
디메틸 설폭 사이드 (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM 고 포도당	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA 테트라 나트륨 염 이수화물	HiMedia	GRM4918
에티듐 브로마이드	Amresco	X328
소 태아 혈청	Gibco	26140079
포름알데히드	Fishser Scientific	12755
젤 문서화 시스템	ALPHA IMAGER
염소 안티-마우스 IgG (H+L) 보조 항체, HRP	Thermo Fisher	A16066
과산화수소 30%	Merck	107209
도립 현미경	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB 육수	HiMedia	M1245
리포펙타민 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection 시약
기계식 피펫 세트	Eppendorf
메탄올	Merck	106009
마이크로 팁 0.2-10 &마이크로; 엘	Tarsons	521000
마이크로 팁 10 - 100 &마이크로; 엘	Tarsons	521010
마이크로 팁 200-1000 &마이크로; 엘	Tarsons	521020
MOPS 버퍼	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. 대장균	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	최소 필수 매체
PCR 튜브 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion  고화질 DNA 중합효소	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
피펫 컨트롤러	길슨
Platinum Taq DNA 중합효소	Thermo	10966034
	Prism GraphPad		통계 분석 소프트웨어
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	바이러스 분리 키트
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR 정제 키트	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA 청소 키트
혈청학 피펫 25 ml	Thermo Fisher	170357N
혈청학 피펫 5 ml	Thermo Fisher	170355N
혈청학 피펫10 ml	Thermo Fisher	170356N
단일 가닥 RNA 마커 0.2-10 kb	Merck	R7020
탈지 우유	HiMedia	M530
소듐 아지드 0.1 M 용액	Merck	8591
SuperScript III 역전사효소	Invitrogen	18080044	역전사
효소 T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 세포 배양 플라스크	Tarsons	159910
T25 세포 배양 플라스크	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express 대규모 RNA 생산 시스템	프로메가	P1320	대규모 RNA 생산 시스템
T75 세포 배양 플라스크	Tarsons	950050
Taq DNA 중합효소	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT  1단계  키트	Thermo Fisher	4392653	상용 qRT-PCR 키트
TOPO-XL--2 Complete PCR 클로닝 키트	Thermo Fisher	K8050-10	키트, long-PCR 제품 클로닝을 위한
Tris 기본	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA 솔루션	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
진공 집중기	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
수조	그랜트	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S