Method Article

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

DOI:

10.3791/63690

⸱

May 5th, 2022

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

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형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.

Abstract

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말초 신경의 미토콘드리아 기능 장애는 말초 신경 병증과 관련된 여러 질병을 동반하며,자가 면역 질환, 당뇨병, 감염, 유전 장애 및 종양을 포함한 여러 원인에 의해 유발 될 수 있습니다. 마우스 말초 신경에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 작은 표본 크기, 조직에 존재하는 제한된 수의 미토콘드리아, 및 미엘린 외피의 존재로 인해 어려울 수 있습니다. 이 연구에 설명 된 기술은 근육 섬유에 사용되는 것으로부터 적응 된 독특한 투과 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아를 조직으로부터 분리하는 대신 좌골 신경 미토콘드리아 기능을 평가함으로써 이러한 도전을 최소화합니다. Amplex Red/Peroxidase로 플루오르 반응성 종 생산을 측정하고 사포닌 투과 신경에서 다른 미토콘드리아 기질과 억제제를 비교함으로써 미토콘드리아 호흡 상태, 반응성 산소 종 (ROS) 및 미토콘드리아 복합체의 활성을 동시에 감지 할 수있었습니다. 따라서, 여기에 제시된 방법은 다른 기술에 의한 미토콘드리아 기능의 평가와 비교하여 이점을 제공한다.

Introduction

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미토콘드리아는 세포 생존력을 유지하고 에너지 대사 (포도당, 아미노산, 지질 및 뉴클레오티드 대사 경로)와 같은 수많은 세포 기능을 수행하는 데 필수적입니다. 반응성 산소 종 (ROS) 생산의 주요 부위로서, 미토콘드리아는 아폽토시스와 같은 여러 세포 신호 전달 과정에서 중심이며 철 - 황 (Fe-S) 클러스터의 합성, 미토콘드리아 단백질 수입 및 성숙, 게놈 및 리보솜 1,2,3의 유지에 참여합니다. 미토콘드리아 막 역학 네트워크는 융합 및 분열 과정에 의해 제어되며, 품질 관리 및 미토파지 4,5,6 용 기계도 갖추고 있습니다.

미토콘드리아 기능 장애는 암, 당뇨병 및 비만과 같은 여러 병리학 적 상태의 출현과 관련이 있습니다7. 미토콘드리아 기능의 교란은 알츠하이머 병 8,9, 파킨슨 병

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Protocol

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본 프로토콜은 연구에서 동물 사용에 관한 윤리위원회, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침에 의해 승인되었습니다. 좌골 신경은 4 개월 된 수컷 C57BL / 6 마우스에서 분리되며, 기관 지침에 따라 자궁 경부 탈구에 의해 안락사됩니다. 프로토콜 단계는 미토콘드리아 악화를 피하기 위해 최적화되어 있습니다. 따라서, 이 프로토콜에서, 편광 산소 센서의 교정은 마우스 좌골 신경 조직 해부 및 투과화 이전에 수행되었다.

1. 시약의 제조

  1. 조직 보존 버퍼(TP 버퍼)를 준비합니다.
    1. 초순수 용액에서 다음 시약을 준비한다: 0.1 μM의 유리 칼슘을 갖는 10 mM의 Ca-EGTA 완충액, 20 mM의 이미다졸, 20 mM의 타우린, 50 mM의 K-MES, 0.5 mM의 DTT, 6.56 mM의MgCl2, 5.77 mM의 ATP, 15 mM의 포스포크레아틴( 물질표 참조), pH 7.1. -20°C에서 보관하십시오.
  2. 미토콘드리아 호흡 완충액(MR 완충액)을 준비한다.
    1. 초순수 용액에서 다음 시약을 준비한다: 0.5 mM의 K2 ....

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Results

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투과된 좌골 신경에 의한 미토콘드리아 산소 소비량은 도 2에 나타내었다. 적색 트레이스는 단위 질량당O2 플럭스를 pmol/s.mg로 나타낸다. 내인성 기질로 기저 산소 소비를 기록한 후(일상적인 호흡), 숙시네이트(SUCC)는 콤플렉스 II(숙시네이트 데하이드로게나제)-구동 호흡을 기록하기 위해 주입되어, 산소 소모율의 증가를 초래한다. 순차적으로, ADP의 포화 농도가 첨가되어, ATP 신타제를 활성화시키고 산화적 인산화를 유도한다. 이것은 미토콘드리아 호흡의 인산 상태를 초래합니다. 인산 상태 호흡은 ATP 합성효소가 ATP26을 생성하는 양성자-동기력으로서 양성자 구배에 의해 형성된 막 전위를 사용하여 ADP+Pi(무기 포스페이트)로부터 ATP를 생성할 수 있음을 의미한다. ATP 신타제 활성에 의해 촉진되는 막 전위의 감소로 인해 산소 소비가 가속화되고 산소 흐름의 증가가 관찰됩니다. 외인성 시토크롬 c .......

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Discussion

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신경 병증을 동반하는 여러 질병 또는 상태는 위험 인자로서 미토콘드리아 기능 장애를 갖는다. 말초 신경에서 미토콘드리아 기능의 평가는 미토콘드리아가 이러한 신경 퇴행성 조건에서 어떻게 작용하는지 밝히는 데 필수적입니다. 미토콘드리아 기능의 평가는 분리 방법의 어려움과 물질의 부족으로 인해 힘들다. 따라서, 미토콘드리아의 단리를 필요로 하지 않는 조직 투과화 기술의 개발이 필수적이다.

투과 조직에서 미토콘드리아 기능을 평가하려면 세포 호흡을 방해하지 않고 세포 원형질막을 투과시킬 수있는 화학 물질을 선택하는 것이 중요합니다. 좌골 신경과 같은 말초 신경에서, 미엘린 조성물은 약 70 %의 지질이며, 그 중 대부분은 콜레스테롤33,34입니다. 콜레스테롤 분자와 상호작용하는 사포닌 및 디지토닌과 같은 투과화제의 선택은 다른 세포 구획을 방해하지 않으면서 미토콘드리아 기계에 기질이 .......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)에 의해 자금을 지원받았다. 우리는 안토니오 갈리나 필로 박사, 모니카 몬테로 로멜리 박사와 클라우디오 마수다 박사에게 실험실 시설에 대한 지원과 마사 소렌슨 박사에게 기사 개선에 친절하고 가치있는 의견을 주신 것에 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아데노신 5' 트리포스페이트 디소듐 염 수화물Sigma-AldrichA26209
아데노신 5&프라임;-디포스페이트 나트륨 염Sigma-AldrichA2754
Amplex Red 시약Thermo Fisher ScientificA12222Amplex Red는 제품 데이터시트
Antimycin A(Streptomyces sp.에서)시그마-알드리치A8674
소 혈청 알부민시그마-알드리치A7030열 쇼크 분율, 프로테아제 프리, 지방산 프리, 본질적으로 글로불린 프리, pH 7, ≥ 98%
탄산칼슘Sigma-AldrichC6763
카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)시그마-알드리치C2920
사이토크롬 c시그마-알드리치C7752(말 심장에서, 작은 반단백질)
DataLab 버전 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AustriaCopyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
디지털 오비탈 마이크로플레이트 쉐이커 120VThermo Fisher scientific88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA 나트륨 염Sigma-AldrichE8145
Hamilton 주사기Sigma-AldrichHAM8007510 uL, 25 uL 및 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
수소 과산화물 용액 30 % W / WMerckH1009
ImidazoleSigma-AldrichI2399
L- (&마이너스;)-말산Sigma-AldrichM7397
염화마그네슘 육수화물Sigma-AldrichM2393
MES 나트륨 염Sigma-AldrichM3885
미세 해부 겸자, 곡선형Sigma-AldrichF4142
미세 해부 집게, 직선Sigma-AldrichF4017
O2K - 필터 세트 Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2K-Fluorometry: HRR 및 H2O2 생산 마우스 뇌 미토콘드리아. Mitochondr Physiol 네트워크 17.17.
O2K - 형광 LED2 - 모듈 구성 요소 형광 센서 녹색OROBOROS INSTRUMENTS, 오스트리아44210-01
올리고마이신시그마-알드리치O4876(스트렙토마이세스 디아스타토크로모진에서, 올리고마이신 A, B 및 C의 혼합물
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, 오스트리아http://www.oroboros.at
팔미토일카르니틴(Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)시그마-알드리치P4509
양고추냉이의 과산화효소시그마-알드리치P8375
페트리 접시, 폴리스티렌MERCKP5606
포스포크레아틴 다이소듐 염 수화물시그마-알드리치P7936
인산이수소 칼륨 일염기성 시그마-알드리치PHR1330
수산화칼륨시그마-알드리치221473
로테논시그마-알드리치R8875
사포닌시그마-알드리치SAE0073
피루브산 나트륨시그마-알드리치P5280
숙시네이트 이염기성 육수화물시그마-알드리치S2378
자당시그마-알드리치S9378
타우린시그마-알드리치T0625
에 따라 DMSO에서 제조됩니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reac....

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