여기에 제시된 것은 시판되는 조직 키트를 사용하여 하나 또는 몇몇 동물로부터 예 쁜꼬마선충 게놈 DNA의 간단하고 비교적 신속한 분리에 대한 설명이다. 생성된 gDNA 제제는 PCR에 적합한 주형이다.
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이 논문에서
요약
초록
단일 또는 몇몇 예쁜꼬마선충으로부터의 게놈 DNA 추출 은 유전자형 분석, 클로닝 및 시퀀싱을 위한 PCR을 포함한 많은 다운스트림 응용을 갖는다. C. elegans 에서 게놈 DNA 추출을위한 전통적인 프로테이나제 K 기반 방법은 몇 시간이 걸립니다. C. elegans 표피를 효과적으로 열고 게놈 DNA를 추출하는 상업적 추출 키트는 제한적입니다. 교실 및 연구 응용 분야에 잘 작동하는 C. elegans 게놈 DNA를 추출하는 쉽고 빠르며 비용 효율적인 방법이 여기에보고되었습니다. 이 DNA 추출 방법은 PCR을 수행하기 위해 신뢰할 수있는 주형을 얻기 위한 출발 물질로서 단일 또는 몇 개의 후기 유충 (L4) 또는 성인 선충류를 사용하도록 최적화되어 있습니다. 결과는 DNA 품질이 PCR에 의해 상이한 크기의 유전자 표적을 증폭시키는 데 적합하다는 것을 나타내며, 반응 당 단일 성인으로부터 게놈 DNA의 일-오십분의 일로 희석 된 경우에도 단일 또는 몇 마리의 동물의 유전자형을 허용한다. 보고된 프로토콜은 PCR 기반 응용을 위해 C. elegans 의 단일 또는 작은 샘플로부터 DNA 주형을 신속하게 생산하는데 신뢰성 있게 사용될 수 있다.
서론
여기에서, PCR 기반 응용을 위해 DNA에 접근할 수 있도록 예쁜꼬마선충의 용해를 위한 두 가지 관련 프로토콜이 제시된다. PCR은 클로닝 및 시퀀싱을 위한 DNA 단편의 지노타이핑 및 증폭을 포함한 많은 응용 분야에 일반적으로 사용되는 분자 기술입니다. 작은 (1mm), 자유 살아있는 회충 C. elegans는 생물학적 연구를위한 인기있는 동물 시스템입니다. 단일 동물 또는 몇몇 동물로부터 적합한 게놈 DNA를 수득하는 것은 PCR에 의해 서열을 증폭시키기에 충분하다. 후기 L4 유충과 성인은 utero 1의 ~ 1,000 개의 체세포 (일부 다중 핵, 다발성 세포 포함), 생식 세포 및 (동물이 gravid hermaphrodite인 경우) 자손 만 포함합니다. 그러나, 이들 동물은 게놈 DNA2를 추출하기 위해 파쇄되어야 하는 표피에 의해 보호된다. PCR을 위해 선충류 게놈 DNA 주형을 준비하는 표준 방법은 여러 단계를 포함하며 몇 시간이 걸립니다. 동물들은 먼저 프로테이나제 K를 함유하는 웜 용해 완충액(-70°C 이하)에서 적어도 15-45분(일부 프로토콜에 의해 더 긴 것이 권장됨)
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프로토콜
1. C. 엘레간 유지 보수
주: N2(야생형) 및 blmp-1(tm548) C. 엘레간 균주는 20°C에서 표준 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트 상에서 유지되었다.
- 23.005 g의 NGM 분말을 973 mL의 물에 용해시켜 NGM 플레이트를 2 L 플라스크에 제조하였다. 플라스크 개구부를 알루미늄 호일(또는 통풍이 가능한 오토클레이브 캡)으로 덮고 오토클레이브 테이프로 덮개를 고정합니다. 오토클레이브는 분말을 용해시키고 적어도 30분의 멸균 주기로 내용물을 멸균한다.
- 배지를 수조에서 60°C로 냉각시킨다.
- 냉각된 매질에, 멸균 1 M 포스페이트 (KH2PO4) 완충액25mL를 첨가하여, pH 6.0; 1 mL의 1 M 염화칼슘 용액; 및 1 mL의 1 M 황산마그네슘 용액.
- 마그네틱 교반 플레이트 상에서 배지를 교반하여 균질한 혼합물을 수득하고 고르지 않은 냉각 및 응고를 방지한다(∼5분). 교반 막대가 소용돌이를 만들 수있을만큼 빠르게 회전하지만 거품이 유입 될 정도로 빠르지는 않은지 확인하십시오 (~ 250-300 rpm).
- 배지 25 mL를 ....
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결과
단일 또는 몇몇 야생형 성인으로부터의 게놈 DNA를 이들 두 방법의 효능을 비교하기 위해 상용 키트 또는 전통적인 용해 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 이 용해물은 ∼2,100 bp ( blmp-1 인코딩)의 더 큰 표적 또는 ∼500 bp의 더 작은 표적 ( sma-10의 일부를 인코딩하는) 중 하나를 증폭하기 위한 PCR용 주형으로 사용되었다. 두 방법 모두 적절한 PCR 산물을 성공적으로 산출했습니다 (그림 1A).
다음으로, 키트-추출된 게놈 DNA가 다양한 DNA 중합효소를 위한 주형으로서 기능하는 능력을 입증하였다. 추출된 게놈 DNA는 상이한 능력(속도, 충실도 및 생성물 크기 포함)을 갖는 네 개의 중합효소를 사용하여 0.5 kb 생성물을 증폭하기 위한 주형으로 사용되었다. 예상된 크기의 생성물은 단일 성인 용해 또는 아홉 성인 용해로부터의 주형을 사용하여 이들 중합효소에 의해 생.......
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토론
C. elegans의 유전자형을 결정하는 것은 새로운 C. elegans 균주를 만들기 위해 유전 적 교차를 수행하는 동안 중요한 단계입니다. 단일 또는 몇 개의 C. elegans를 이용한 게놈 DNA 추출은 C. elegans를 지노타이핑하는 데 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 상용 키트를 사용하여 C. elegans로부터의 게놈 DNA 추출을 기술한다. 이 방법은 빠르며 강력하게 작동합니다. 이 방법을 사용하여 추출된 게놈 DNA는 유전자형, 시퀀싱 및 클로닝을 포함한 하류 응용에 사용될 수 있다. 기술된 DNA 추출 방법은 DNA 주형에 대한 출발 물질로서 단일 및 몇 개의 L4 또는 성인 동물을 사용하여 C. elegans 유전자 교차를 지노타이핑하기 위해 최적화되었다. 3.5마리의 동물(도 1D)에 대한 1-5개의 동물(도 1C
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
N2 균주 및 대장균 OP50 박테리아는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)가 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)로부터 수득되었다. blmp-1(tm548) 균주는 일본 국립 생물자원 프로젝트로부터 입수하였다. 저자는 웜베이스에 감사드립니다. 이 작업은 NIH R01GM097591에서 T.L.G., Texas Woman 's University가 T.L.G.에 내부 자금을 지원하고, TWU의 학생 연구 센터가 M.F.L.에 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 오토클레이브 테이프 | 방어 | 43237-2 | |
| 알루미늄 호일, 헤비 듀티 | 레이놀즈 랩 | 2182934 | |
| 염화칼슘 | Millipore Sigma | 102382(CAS 10035-04-8) | |
| 추출물-N-Amp 키트(조직 준비 솔루션, 추출 솔루션 및 중화 솔루션 포함) | Sigma-Aldrich Co. | LLC XNAT2-1KT | |
| Isotemp 핫플레이트/교반기 | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB 매체, Lennox, 캡슐 | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| 황산마그네슘, 순도 97%, 무수 | Thermo Scientific | AC413485000(CAS 7487-88-9) | |
| 마이크로 원심분리기 | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U 핫 스타트 고충실도 DNA 중합효소 | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E"는 고속, 고충실도 중합효소(20– 30 s/kb) |
| NGM 미디어 파우더 | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR 마스터 믹스(HF 버퍼 포함 | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D"는 고속, 고충실도 중합효소(15– 30 s/kb) |
| 프라이머 | Integrated DNA Technologies | , 맞춤형 DNA 올리고, | |
| PrimeSTAR, GXL, 중합효소 | Takara Bio, Inc. | R050B | "Pol C", GC가 풍부한 템플릿 및 최대 30kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder(0.1– 10.0 kb) | 뉴잉글랜드 바이오랩, Inc. | N0550S | |
| 사파이어앰프 패스트 PCR 마스터 믹스 | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A", 그림 1A, C, D에 사용된 중합효소, 최대 5kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR 반응 혼합물 | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | 1B의 "Pol B", 최대 7kb 표적을 위한 중합효소(1분/kb) |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| 교반봉 | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| 와류 믹서 | Fisher Scientific | 2215365 | |
| 웜 픽 | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
참고문헌
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
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재인쇄 및 허가
