Caenorhabditis elegans Genomic DNA의 소규모 추출

여기에서, PCR 기반 응용을 위해 DNA에 접근할 수 있도록 예쁜꼬마선충의 용해를 위한 두 가지 관련 프로토콜이 제시된다. PCR은 클로닝 및 시퀀싱을 위한 DNA 단편의 지노타이핑 및 증폭을 포함한 많은 응용 분야에 일반적으로 사용되는 분자 기술입니다. 작은 (1mm), 자유 살아있는 회충 C. elegans는 생물학적 연구를위한 인기있는 동물 시스템입니다. 단일 동물 또는 몇몇 동물로부터 적합한 게놈 DNA를 수득하는 것은 PCR에 의해 서열을 증폭시키기에 충분하다. 후기 L4 유충과 성인은 utero 1의 ~ 1,000 개의 체세포 (일부 다중 핵, 다발성 세포 포함), 생식 세포 및 (동물이 gravid hermaphrodite인 경우) 자손 만 ^{포함합니다.} 그러나, 이들 동물은 게놈 DNA²를 추출하기 위해 파쇄되어야 하는 표피에 의해 보호된다. PCR을 위해 선충류 게놈 DNA 주형을 준비하는 표준 방법은 여러 단계를 포함하며 몇 시간이 걸립니다. 동물들은 먼저 프로테이나제 K를 함유하는 웜 용해 완충액(-70°C 이하)에서 적어도 15-45분(일부 프로토콜에 의해 더 긴 것이 권장됨)^3,4,5,6 동안 동결된다. 이 단계는 동물을 열어줍니다.

동결 후, 동물을 프로테이나제 K가 작용하도록 60-65°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 효소를 95°C에서 15-30분 동안 불활성화시킨다. 프로테이나제 K는 DNA를 분해하는 뉴클레아제를 파괴합니다. PCR 전에 프로테이나제 K의 불활성화는 프로테이나제 K가 DNA 중합효소를 분해하는 것을 방지하는 데 중요하다. 여기에 설명 된 두 가지 키트 기반 프로토콜은 일상적인 연구 및 교육 실험실 응용 프로그램을 위해 단일 동물 또는 몇 마리의 선충류에서 게놈 DNA를 추출하는 빠르고 안정적이며 비용 효율적인 방법입니다. 사용 된 키트는 원래 제조업체가 동물 조직, 타액 및 모발에서 DNA를 추출하도록 최적화되었습니다⁷. 독점적 인 조직 준비 솔루션과 추출 용액을 사용하여 세포를 용해시키고 게놈 DNA에 접근 할 수 있도록합니다. 그런 다음 독점 중화 용액은 PCR을 억제할 수 있는 성분(예: 염, 이온 및^Mg2+ 결합 분자)을 중화시킵니다.

유전자형을 만들 때 단일 동물을 테스트 할 수 있습니다. 균주가 동형접합성인지 판단할 때, 단일 동물로부터 6개 이상의 자손을 시험하는 것은 선이 동형접합성인지 아닌지에 대한 높은 확신을 준다(이형접합성 부모로부터 6개의 동형접합성 돌연변이 자손을 무작위로 선별할 확률은 0.02%이다[(1/4)⁶ × 100% = 0.02%]). 이 방법은 1) 프로테이나제 K 방법보다 적은 단계로, 간단하고, 2) 주형 준비 시간을 15분으로 감소시킨다. 이 연구의 결과는 개발 된 프로토콜이 단일 또는 몇 개의 웜에서 게놈 DNA를 추출하는 데 강력하게 작동한다는 것을 보여 주며, 이는 PCR을 포함하여 고도로 정제 된 DNA를 필요로하지 않는 하류 응용 분야에 안정적으로 사용될 수 있습니다.

1. C. 엘레간 유지 보수

주: N2(야생형) 및 blmp-1(tm548) C. 엘레간 균주는 20°C에서 표준 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트 상에서 유지되었다.

1. 23.005 g의 NGM 분말을 973 mL의 물에 용해시켜 NGM 플레이트를 2 L 플라스크에 제조하였다. 플라스크 개구부를 알루미늄 호일(또는 통풍이 가능한 오토클레이브 캡)으로 덮고 오토클레이브 테이프로 덮개를 고정합니다. 오토클레이브는 분말을 용해시키고 적어도 30분의 멸균 주기로 내용물을 멸균한다.
2. 배지를 수조에서 60°C로 냉각시킨다.
3. 냉각된 매질에, 멸균 1 M 포스페이트 (KH2PO4) 완충액₂₅mL를 첨가하여, pH 6.0; 1 mL의 1 M 염화칼슘 용액; 및 1 mL의 1 M 황산마그네슘 용액.
4. 마그네틱 교반 플레이트 상에서 배지를 교반하여 균질한 혼합물을 수득하고 고르지 않은 냉각 및 응고를 방지한다(∼5분). 교반 막대가 소용돌이를 만들 수있을만큼 빠르게 회전하지만 거품이 유입 될 정도로 빠르지는 않은지 확인하십시오 (~ 250-300 rpm).
5. 배지 25 mL를 각 10 cm 페트리 플레이트 (총 40 플레이트)에 붓는다. 플레이트를 실온에서 밤새 건조시킨다(전형적으로 16-25°C).
6. 에스케리치아 콜리 OP50의 콜로니를 37°C에서 하룻밤 동안 LB 브로스 30-50 mL에 성장시킨다.
7. 각 플레이트를 500 μL의 대장균 OP50 배양액으로 시드하고 사용 전에 실온 (전형적으로 16-25°C)에서 건조시킨다⁸. 플레이트를 최대 3주 동안 4°C에서 보관한다.
8. C. 엘레간을 와이어 픽 또는 다른 방법을 사용하여 시딩된 플레이트에 옮기고 균주에 필요한 온도에서 L4 또는 성인 단계로 성장시키게 하였다(전형적으로 16-25°C, 동물을 도어로서 굶주린 채로 플레이팅한 경우 1-2일, 동물을 배아로 플레이팅한 경우 3-4일)⁸.

2. 단일 웜 DNA 추출

참고: 이 방법은 단일 웜(총 부피의 1.8μL에 있는 하나의 웜)에서 DNA를 추출하는 데 유용합니다. 한 번에 여러 웜이 용해되는 경우 마스터 믹스를 만들 수 있습니다.

1. 55°C에서 10분 동안 1 사이클 동안 열사이클러를 프로그램하고, 이어서 95°C에서 3분 동안 프로그램한다(용해 프로그램).
2. 키트로부터 추출 용액 0.8 μL를 얼음 위에 0.2 mL PCR 튜브의 내벽 상에 분취한다. 0.2 μL의 조직 준비 용액을 키트로부터 추출 용액의 액적에 첨가한다. 피펫팅으로 혼합하십시오.
3. 해부 현미경으로 L4 또는 성인 동물을 확인하십시오⁹. L4 hermaphrodites를 식별하려면 동물 한가운데에 창백한 반원으로 보이는 특징적인 외음부를 찾으십시오. 자궁에 타원형 배아가 보일 수있는 판에서 가장 큰 동물을 찾아 성인 hermaphrodite를 확인하십시오.
4. 백금 와이어 픽을 사용하여, 선택된 동물을 용액 10 내로^옮긴다.
5. 튜브를 실온에서 간단히 (2-3 s, ≤6,000 rpm/2,000 × g) 원심분리하여 튜브 바닥에서 내용물을 수집한다.
6. 튜브를 열순환기에 넣고 단계 2.1에서 설정된 용해 프로그램을 실행합니다.
7. 프로그램이 완료되면 튜브를 간단히 원심 분리하여 얼음 위에 놓습니다. 0.8 μL의 중화 용액을 키트로부터 혼합물에 첨가한다. 피펫팅으로 혼합하십시오.
8. 튜브를 실온에서 간단히 원심분리한다(2-3초, ≤6,000rpm/2,000 × g).
9. 용해물을 PCR을 위해 직접 사용하거나 향후 사용을 위해 4 °C 또는 -20 °C에 보관하십시오.
   참고: 추출된 DNA는 4°C 또는 -20°C에서 적어도 6개월 동안 안정^하다7.

3. 소수의 개인의 DNA 추출

참고 :이 방법은 몇 가지 웜에서 DNA를 추출하는 데 유용합니다. 한 번에 여러 균주가 용해되는 경우 마스터 믹스를 준비 할 수 있습니다.

1. 열순환기를 55°C에서 10분 동안 한 사이클 동안 프로그램하고, 이어서 95°C에서 3분 동안 프로그램한다(용해 프로그램).
2. 키트로부터 추출 용액 2.0 μL를 얼음 위에 0.2 mL PCR 튜브의 내벽 상에 분취한다. 0.5 μL의 조직 준비 용액을 키트로부터 추출 용액의 액적에 첨가한다. 피펫팅으로 혼합하십시오.
3. 해부 현미경으로 L4 또는 성인 동물을 확인⁹. L4 hermaphrodite는 동물의 중앙에 창백한 반원으로 보이는 특징적인 외음부를 가지고 있습니다. 성인 hermaphrodite는 판에서 가장 큰 동물이며 자궁에서 타원형 배아가 보일 수 있습니다.
4. 백금 와이어 픽을 사용하여 몇 마리의 동물을 용액으로 옮깁니다: 9마리의 동물은 용해물 0.5μL당 게놈 DNA 1마리를 산출하고, 16마리는 0.25μL(3.5마리의 선충류/μL)의 게놈 DNA에 해당하는 동물 1마리를 산출합니다¹⁰.
   참고 : 16 마리 이상의 동물을이 볼륨으로 옮기는 것은 어렵습니다.
5. 튜브를 실온에서 간단히 원심분리한다(2-3초, ≤6,000rpm/2,000× g).
6. 튜브를 열순환기에 넣고 단계 3.1에서 설정된 용해 프로그램을 실행합니다.
7. 프로그램이 완료되면 튜브를 간단히 원심 분리하여 얼음 위에 놓습니다. 2 μL의 중화 용액을 키트로부터 혼합물에 첨가한다. 피펫팅으로 혼합하십시오.
8. 튜브를 실온에서 간단히 원심분리한다(2-3초, ≤6,000rpm/2,000 × g).
9. PCR을 위해 용해물을 직접 사용하거나 향후 사용을 위해 4 °C 또는 -20 °C에 보관하십시오.
   참고: 추출된 DNA는 4°C 또는 -20°C에서 적어도 6개월 동안 안정^하다7.

4. PCR 반응

참고: 빠른 중합효소를 사용하여 결실 돌연변이를 검출하는 이 웜 용해 기술의 한 다운스트림 적용이 설명됩니다. 반응 당 웜의 1/50^th 까지 희석에서 성공적인 PCR을 위해 게놈 주형 DNA를 생산하는 두 개의 웜 용해 프로토콜의 효과도 입증됩니다.

1. 단계 2 및 단계 3에서 상기 기재된 바와 같이 야생형 N2 및 돌연변이 균주를 사용하여 단일 웜 및 16개의 웜으로부터 DNA를 추출한다.
2. 야생형 N2 동물로부터 단일 웜 DNA의 2배, 10배, 20배 및 50배 희석액을 준비한다.
3. 관심 서열과 핫스타트 PCR 마스터 믹스에 특이적인 프라이머를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 반응을 설정한다(표 1 및 표 2). 희석되지 않은 DNA 1 μL 또는 희석된 DNA 2 μL를 각 반응에서 주형으로 사용하십시오.
4. PCR 산물을 겔 전기영동 및 이미징¹¹로 확인하였다.

단일 또는 몇몇 야생형 성인으로부터의 게놈 DNA를 이들 두 방법의 효능을 비교하기 위해 상용 키트 또는 전통적인 용해 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 이 용해물은 ∼2,100 bp ( blmp-1 인코딩)의 더 큰 표적 또는 ∼500 bp의 더 작은 표적 ( sma-10의 일부를 인코딩하는) 중 하나를 증폭하기 위한 PCR용 주형으로 사용되었다. 두 방법 모두 적절한 PCR 산물을 성공적으로 산출했습니다 (그림 1A).

다음으로, 키트-추출된 게놈 DNA가 다양한 DNA 중합효소를 위한 주형으로서 기능하는 능력을 입증하였다. 추출된 게놈 DNA는 상이한 능력(속도, 충실도 및 생성물 크기 포함)을 갖는 네 개의 중합효소를 사용하여 0.5 kb 생성물을 증폭하기 위한 주형으로 사용되었다. 예상된 크기의 생성물은 단일 성인 용해 또는 아홉 성인 용해로부터의 주형을 사용하여 이들 중합효소에 의해 생성되었다(도 1B). 주형 서열을 정확하게 증폭하는 PCR 중합효소의 주형 서열 및 충실도는 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다(보충 도 S1). 이러한 결과는 키트 프로토콜로부터 추출된 게놈 DNA가 다양한 중합효소에 적합한 주형을 제공한다는 것을 입증한다.

PCR 효능은 상용 키트를 사용하여 단일 동물로부터 추출된 게놈 DNA의 상이한 농도를 사용하여 시험하였다. DNA를 2-, 10-, 20-, 또는 50-배로 희석하고, 반응 당 웜의 약 1-절반, 10-10-10-10-10-10-10-10-10-10-, 및 1-5-5-에 상응하는 것을 PCRs에 사용하였다. 이들 DNA 주형 농도는 ~2.1kb의 더 큰 표적 또는 ~0.5kb의 더 작은 표적(도 1C)12의 증폭을 지원하였다. 0.5 kb PCR 산물의 DNA 농도 의존적 수율이 관찰된 반면, 2.1 kb PCR 산물 수율은 모든 반응에서 동등하게 나타났다.

이들 프로토콜이 PCR 유전자형화에 적합한 C. elegans로부터 게놈 DNA를 생성한다는 것을 입증하기 위해, 게놈 DNA를 단일 및 16개의 야생형 및 blmp-1 기능 상실 돌연변이체(blmp-1(tm548))로부터 추출하였다. blmp-1 유전자는 원위 팁 세포 이동, 신체 크기 및 발달12,13,14,15,16에서 중요한 역할을 하는 전사 인자를 코딩한다. blmp-1 돌연변이체는 엑손 3 및 인트론 3 15의 일부를 제거하는810 bp 결실을 갖는다. 야생형 DNA 주형이 사용될 때 2,134 bp 생성물을 초래하고 blmp-1(-) DNA가 사용되는 경우 1,324 bp 생성물을 초래하는 프라이머를 설계하였다. 적절한 크기의 PCR 산물은 L4 단계화된 동물(반응 당 3.5개의 웜)으로부터 1μL의 단일 웜(반응 당 약 0.5개의 웜) 또는 16-웜 용해를 사용하여 검출되었다(도 1D). 이 결과는 두 프로토콜 중 하나를 사용하여 키트로 추출된 게놈 DNA가 유전자형 라인에 대한 PCR에 동등하게 효과적인 주형을 제공한다는 것을 보여준다.

이러한 결과는 단일 및 다중 동물로부터의 상용 조직 DNA 추출 키트를 사용하는 C. elegans 게놈 DNA 제제가 PCR의 주형으로 안정적으로 사용될 수 있음을 보여준다.

그림 1: 단일 선충류 및 다중 선충류로부터의 상용 키트를 사용하는 DNA 제제는 PCR에 의한 강력한 증폭을 허용한다. PCR 산물을 1x TAE 완충액 (5 μL (A,B) 또는 10 μL (C,D)의 1% 아가로스 겔에 로딩하고, 90-100 V에서 30분 내지 2 h 동안 실행하였다. 2-log DNA 사다리를 모든 겔에 사용하였다. (A) 키트에 의한 DNA 용해를 전통적인 프로테이나제 K 방법과 비교하여 두 개의 프라이머 세트를 사용하여 주형을 만든다. 야생형 성인을 용해시키고, 한 마리의 동물과 동등한 동물을 모든 반응의 주형으로 사용하였다. 레인 1-4, 2.1kb 제품. 레인 1, 프로테이나제 K. 레인 2에 의한 단일 웜 용해로부터의 PCR, 키트 방법에 의한 단일 웜 용해로부터의 PCR. 레인 3, 프로테이나제 K. 레인 4에 의한 9개의 웜 웜 용해로부터의 PCR, 키트 방법에 의한 9개의 웜 웜 용해로부터의 PCR. 레인 5-8, 0.5kb 제품. 레인 5는, 프로테이나제 K. 레인 6에 의한 단일 웜 용해로부터의 PCR, 키트 방법에 의한 단일 웜 용해로부터의 PCR. 레인 7, 프로테이나제 K. 레인 8에 의한 아홉 웜 웜 용해로부터의 PCR, 키트 방법에 의한 9-웜 웜 용해로부터의 PCR. (b) DNA 용해를 위한 키트 방법은 다중 중합효소에 의한 PCR에 적합한 주형을 제공한다. 야생형 성인은 키트 방법을 사용하여 용해시키고, 동물의 절반에 해당하는 것을 0.5kb 생성물에 대한 PCR 주형으로 사용하였다. 중합효소 세부사항에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 레인 1, 고속 중합효소를 이용한 단일 웜 용해로부터의 PCR. 레인 2, 고속 중합효소를 이용한 아홉 개의 웜 용해로부터의 PCR이다. 레인 3, Taq 중합효소를 사용한 단일 웜 용해로부터의 PCR. 레인 4는, Taq 폴리머라제를 사용한 9개의 웜 용해로부터의 PCR이다. 레인 5, 고충실도 폴리머라제를 사용한 단일 웜 용해로부터의 PCR. 레인 6, 고충실도 폴리머라제를 사용한 아홉 개의 웜 용해로부터의 PCR. 레인 7, 고속, 고충실도 폴리머라제를 사용한 단일 웜 용해로부터의 PCR. 레인 8, 고속, 고충실도 폴리머라제를 사용한 아홉 개의 웜 용해로부터의 PCR. (c) 하나의 야생형 L4 웜 용해의 희석은 PCR을 위한 주형을 제공한다. 레인 1-5, 2.1kb 제품. 레인 6-10, 0.5kb 대상. 레인 1 및 레인 6, 희석되지 않은 DNA. 레인 2 및 레인 7, 2배 희석된 DNA. 레인 3 및 레인 8, 10배 희석된 DNA. 레인 4 및 레인 9, 20배 희석된 DNA. 레인 5 및 레인 10, 50배 희석된 DNA. (d) 1 μL의 단일- 및 16-웜 DNA 제제를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 blmp-1 유전자좌를 유전자형화한다. 레인 1, 야생형 단일 웜 용해로부터의 PCR. 레인 2, blmp-1(-) 단일 웜 용해로부터의 PCR이다. 레인 3, 야생형 16-웜 용해로부터의 PCR. 레인 4, blmp-1(-) 16- 웜 용해로부터의 PCR이다. 약어 : 준비 = 준비 방법; kb = 킬로베이스; st. = 선충류 단계; dil. = DNA의 희석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 프라이머 목록.

표 2: PCR 반응 성분.

보충 도표 S1: 상용 키트로 제조된 게놈 DNA의 품질을 확인하기 위한 시퀀싱. 두 개의 시퀀싱 반응으로부터의 결과는 16-웜 용해로부터 고속, 고충실도 중합효소(Pol E)에 의해 증폭된 DNA의 1,600개 이상의 DNA의 예상된 서열과 완전히 일치한다(표 1, 표 2A, 및 표 2D). 시퀀싱 읽기 끝은 낮은 품질의 기본 읽기를 제거하기 위해 트리밍되었습니다. 정렬은 EMBL-EBI 다중 서열 정렬 도구 MUSCLE (로그-기대에 의한 MUltiple 서열 비교)17을 사용하여 수행하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.