생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.
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방법 논문
인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
장 점막은 무수한 중요한 기능을 수행하는 복잡한 물리적, 생화학적 장벽입니다. 그것은 영양소와 이종 바이오틱스의 운반, 흡수 및 신진 대사를 가능하게하면서 미생물과의 공생 관계를 촉진하고 미생물의 침입을 제한합니다. 다양한 세포 유형과 물리적 및 생화학적 환경 간의 기능적 상호 작용은 장 조직 항상성을 확립하고 유지하는 데 필수적입니다. 이러한 복잡한 상호 작용과 통합 된 장 생리학을 시험관 내에서 모델링하는 것은 새로운 치료 표적 및 약물 후보가 발견되고 개발되는 방식을 변화시킬 수있는 잠재력을 가진 강력한 목표입니다.
Organoids 및 Organ-on-a-Chip 기술은 최근 시험 관 내에서 장 생리학 및 병리 생리학의 기능적 측면을 연구하는 데 적합한 인간 관련 장 칩을 생성하기 위해 결합되었습니다. 소장 (십이지장) 및 대장의 생검에서 유래 된 오가노이드는 장기 칩의 상부 구획에 시딩 된 다음 각 장 영역의 뚜렷한 세포, 분자 및 기능적 특징을 보존하면서 단층으로 성공적으로 확장됩니다. 인간 장 조직-특이적 미세혈관 내피 세포는 상피-내피 계면을 재생성하기 위해 기관 칩의 하부 구획에 혼입된다. 이 새로운 플랫폼은 영양소, 약물 및 미생물에 대한 발광 노출을 용이하게하여 장 수송, 투과성 및 숙주 - 미생물 상호 작용에 대한 연구를 가능하게합니다.
여기서, 인간 십이지장 (십이지장 칩) 및 결장 (결장 칩)을 나타내는 장 칩의 확립을 위한 상세한 프로토콜이 제공되고, 이들의 후속 배양은 연속 유동 및 연동 유사 변형 하에서 제공된다. 우리는 원형 유도제 및 기질을 사용하여 십이지장 칩에서 약물 대사 및 CYP3A4 유도를 평가하는 방법을 시연합니다. 마지막으로, 우리는 결장 칩에서 인터페론 감마(IFNγ) 매개 장벽 파괴(leaky gut syndrome)의 시험관 내 모델링을 위한 단계별 절차를 제공하며, 칩 내 세포의 부세포 투과성의 변화, 사이토카인 분비의 변화, 및 전사체 프로파일링을 평가하는 방법을 포함한다.
서론
인간의 창자는 자기 재생이 가능한 복잡하고 멀티 태스킹 기관입니다. 그것은 소장과 대장으로 나뉩니다. 소장의 주요 기능은 위장에서 나오는 음식을 더 소화하고 모든 영양소를 흡수하며 잔류 물을 대장으로 전달하여 물과 전해질을 회수하는 것입니다. 소장은 해부학적으로 구별되는 여러 영역으로 더 나뉘어집니다 : 십이지장, 제주눔 및 장폐색은 각각 특정 기능을 수행하도록 조정됩니다. 예를 들어, 십이지장은 제주눔에서 단백질, 탄수화물, 비타민 및 미네랄을 포함하는 영양소의 적절한 흡수를 가능하게하기 위해 chyme (위 내용물)을 분해하는 데 도움이됩니다. 소장의 이러한 근위 부분은 또한 장내 약물 흡수 및 대사의 주요 부위이며, 장폐색 및 결장1에서의 발현에 비해 약물 대사 효소 (예를 들어, CYP3A4)의 발현이 더 높은 것을 특징으로합니다. 영양소의 소화 및 흡수에 대한 주요 역할 외에도 창자는 병원성 미생물, 미생물 대사 산물,식이 항원 및 독소 2,3과 같은 잠재적으로 유해한 발광 내용물에 대한 효과적인 장벽이기도합니다. 인간의 결장에는 많은 수의 미생물이 서식하고 있으며, 인체의 총 세포보다 훨씬 많으며 영양, 신진 대사 및 면역에 많은 이점....
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프로토콜
참고: 모든 세포 배양은 적절한 무균 기술을 사용하여 처리되어야 합니다.
이 연구에 사용 된 인간 장 오가노이드는 존스 홉킨스 대학에서 얻었으며 모든 방법은 승인 된 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 존스 홉킨스 대학 기관 검토위원회 (IRB #NA 00038329)의 승인을 받았다.
1. 세포배양시약의 제조
- 제조업체의 지시 사항 (재료 표)에 따라 인간 오가노이드 성장 배지를 준비하고 100 μg / mL의 프리모신으로 보충하십시오.
- 제조업체의 지시 사항 (재료 표)에 따라 인간 미세 혈관 내피 세포 성장 배지를 준비하고 프리모신 100 μg / ml 대신 1:20 vol / vol FBS 및 50 μg / ml로 보충하십시오.
- Y-27632(Rho-kinase Inhibitor)를 멸균된 0.1% BSA에 DPBS에 재현탁시켜 10 mM 원액을 제조하였다. 분취량을 멸균 마이크로튜브에 넣고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관한다.
- CHIR99021 (GSK-3 억제제)을 멸균 디메틸설폭사이드(DMSO)에....
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결과
도 1D 는 장 칩 배양의 타임라인을 요약하고, 칩 상에 시딩하기 전과 시의 장 내피 세포 및 오가노이드를 예시한다. 또한, 십이지장과 결장 칩 사이의 뚜렷한 형태 학적 차이를 보여 주며, 십이지장 칩에 융모와 같은 형성의 존재와 작은 장 구조의 대표에 의해 강조됩니다.
도 3A,B는 3개의 상이한 오가노이드 공여체로부터의 십이지장 칩에서의 폴드 CYP3A4 유도 반응을 입증한다. 칩을 48시간 동안 20μM RIF 또는 100nM VD3에 노출시키고, CYP450 효소의 mRNA 수준(A) 및/또는 폴드 촉매 활성(B)을 평가하는데 사용되었다. 테스토스테론 대사산물인 6β-하이드록시테스토스테론(6β-OH-T)의 증가된 수준은 상승된 CYP3A4 mRNA 유전자 발현과 일치하며, RI.......
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토론
장기 온 칩 기술과 장내 오가노이드의 결합은 인간의 장 생리학 및 병리 생리학의 정확한 모델링을 약속합니다. 여기서, 우리는 미세유체 장치에서 공동 배양된 생검 유래 소장 또는 결장 상피 및 장 미세혈관 내피 세포를 함유하는 장 칩의 확립을 위한 간단하고 강력한 단계별 프로토콜( 도 1에 요약됨)을 제공한다. 인간 창자에 대한 이 칩 기반 시뮬레이션은 생리적, 발광적, 혈관 흐름과 연동 운동과 같은 움직임을 통합합니다. 또한, 우리는 십이지장 칩의 약물 대사 및 결장 칩의 장벽 기능과 같은 중요한 장 기능의 평가를위한 절차를 설명합니다.
장내 항상성의 유지와 칩상의 장 조직의 정확한 모델링에 필수적인 상피-내피 세포 상호작용을 재구하기 위해서는 PDMS 막의 양쪽에 기능적이고 온전한 세포 단층을 확립하는 것이 중요하다. 성공적인 칩 시딩을 향한 첫 번째 단계는 PDMS 표면과 ECM 단백질 사이의 안정적인 결합의 개발을 허용하.......
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공개 사항
Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi 및 Magdalena Kasendra는 Emulate Inc.의 현재 또는 이전 직원이며 지분을 보유 할 수 있습니다. Emulate Inc.는 오르간 칩 장치를 제조하고이 기사에 명시된 작업과 관련된 특허를 발표 한 회사입니다.
감사의 글
우리는 장 생검 유래 오가노이드를 제공 한 Mark Donowitz 교수와 칩, 휴대용 및 문화 모듈의 과학적 삽화를 설계 한 Brett Clair에게 감사드립니다. 나머지 모든 과학적 삽화는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 소장 인간 장 미세혈관 내피 세포 | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 세포 M/ml ; 냉동 보존 |
| 결장 인간 장 미세혈관 내피 세포 | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 세포 M/ml ; 냉동 보존 |
| 생검 유래 인간 십이지장 오가노이드 | John Hopkin's University | - | 오가노이드는 Mark Donowitz 교수(Institutional Review Board 번호: NA_00038329)가 제공했습니다. |
| 생검 유래 인간 결장 오가노이드 | John Hopkin's University | - | 오가노이드는 Mark Donowitz 교수(기관 검토 위원회 번호: NA_00038329)가 제공했습니다. |
| 조&음; CM-1&트레이드; 문화 모듈 | 에뮬레이트 Inc. | - | 문화 모듈 |
| Orb-HM1™ 허브 모듈 | 에뮬레이트 Inc. | - | 5% CO2, 진공 스트레치 및 전원 공급 |
| 장치 Chip-S1™ 스트레치블 칩 | 에뮬레이트 Inc. | - | 오르간 칩 |
| 팟&트레이드; 휴대용 모듈 | 에뮬레이트 Inc. | - | 휴대용 모듈 |
| UV 라이트 박스 | 에뮬레이트 Inc. | - | - |
| 칩 요람 | 에뮬레이트 Inc. | - | 1 per square culture dish |
| Steriflip®-HV 필터 | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 &뮤; 엠 PVDF 필터 |
| 스퀘어 셀 배양 접시 (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | - |
| 핸드헬드 진공 흡인기 | Corning | 4930 | - |
| 흡인 피펫 | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, 폴리스티렌, 개별적으로 포장 |
| 흡인 팁 | - | 멸균(오토클레이브) | |
| 혈청학 피펫 | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, 과 25 mL 낮은 내독소, 멸균 | |
| 피펫 | P20, P200, P1000 및 표준 멀티채널 | ||
| 피펫 팁 | P20, P200, 과 P1000입니다. | ||
| 원뿔형 튜브 ( 단백질 로바인드® 튜브) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL, 50 mL 튜브 |
| Eppendorf 튜브® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL 튜브 |
| 96 웰 블랙 월 플레이트 | - | - | 상피 투과성 분석용 |
| 현미경 (카메라 포함) | - | - | 명시야용 이미징 |
| 수조(또는 구슬) | - | - | 37°C로 설정; C |
| 진공 설정 | -- | 최소 압력: -70 kPa | |
| 세포 스크레이퍼 | 비오튬 | 220033 | |
| T75 플라스크 | BD Falcon | 353136 | 세포 배양 플라스크 |
| 에뮬레이트 시약-1 ( ER-1) | 주식회사 에뮬레이트 | - | 칩 코팅 솔루션 |
| 에뮬레이트 시약-2 ( ER-2) | 에뮬레이트 Inc. | ● | 칩 코팅 용액 |
| Dulbecco 」 s PBS (디펜스) | Corning | 21-031-CV | 1X |
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| Trypan 블루 | 시그마 | 93595 | 세포 계수용 |
| TryplE 익스프레스 | 써모피셔 과학적 | 12604013 | 오가노이드 해리 및 내피 세포 분리 솔루션 |
| 고급 DMEM/F12 | ThermoFisher 과학적인 | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ 오가노이드 성장 매체 (인간) | 줄기 세포 기술 | 06010 | 오가노이드 성장 매체 |
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| 피브로넥틴 | 코닝 | 356008 | ECM 구성 요소 |
| Y-27632 | 줄기 세포 기술 | 72304 | 오가노이드 배지 보충제 |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | 오가노이드 매체 보충제 |
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| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma | A9576 | 30%, 멸균 |
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| DMSO | Sigma | D2650 | 솔벤트 |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg 분말 |
| 리팜피신 (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP 유도제 |
| 테스토스테론 수화물 | Sigma | T1500 | CYP 기질 |
| 1,25-dihyroxy 비타민 D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP 유도제 |
| 아세토니트릴 0.1% (v/v) 포름산 | Sigma | 159002 | LCMS 정지 용액 |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% 파라포름알데히드 (PFA) | EMS | 157-4 | 고정제 |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| 일반 당나귀 세럼 (NDS) | Sigma | 566460 | |
| 안티-오클루딘 | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | 타이트 접합 마커 |
| 안티-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | tight junctions marker |
| anti-E-cadherin | Abcam | ab1416 | epithelial adherens junctions marker |
| anti-VE-cadherin | Abcam | ab33168 | endothelial adherent junctions marker |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | tight junctions marker |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | 핵 염색 |
| 2-메르캅토에탄올 | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA 미니 키트 | Invitrogen | 12183020 RNA 용해, 분리 및 정제 키트 | |
| SuperScript™ IV 빌로&트레이드; 마스터 믹스 | Invitrogen | 11756050 | 역전사 효소 키트 |
| TaqMan™ Fast Advanced Master | Mix Applied Biosystems | 4444557 qPCR 시약 | |
| QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28573 | Real-time PCR cycler |
| 18S 프라이머 | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | 진핵생물 18S rRNA |
| CYP3A4 프라이머 | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Cytochrome 패밀리 3 subfamily A 회원 4 |
| 피어스&트레이드; Coomassie Plus(Bradford) 분석 키트 | ThermoFisher Scientific | 23236 | 단백질 정량화 키트 |
| MSD Tris 용해 완충액 | 메조 스케일 진단 | R60TX-3 | 단백질 용해 완충액 |
| 절단/총 카스파제-3 전체 세포 용해물 키트 | 메조 스케일 진단 | K15140D | Caspase 3 검출 키트 |
| V-PLEX, 혈관 손상 패널 2, 인간 키트 | 메조 스케일 진단 | K15198D | |
| V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | 메조 스케일 진단 | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | - | 컨포칼 현미경 |
| Zeiss LD Plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss-20X 장거리 대물 렌즈 | ||
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss-Brightfield microscope | ||
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss-10X 대물 렌즈 |
참고문헌
- Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
- Okumura, R., Takeda, K.
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