방법 논문

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

DOI:

10.3791/63735

⸱

2022년 5월 4일

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

이 논문에서

요약

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번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

초록

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질량 분광법은 번역 후 변형 (PTM)에 대한 깊은 범위를 제공 할 수 있지만, 복잡한 생물학적 매트릭스로부터의 이러한 변형의 농축은 종종 비 변형 된 분석물에 비해 낮은 화학량론으로 인해 필요합니다. 상향식 프로테오믹스 워크플로우에서 펩티드에 대한 PTM의 대부분의 농축 워크플로우는 생성된 펩티드가 분석되기 전에 단백질이 효소적으로 소화되고, 오직 한 가지 유형의 변형만을 풍부하게 한다. 그러나 PTM의 전체 보완은 생물학적 기능을 유도하고 단일 유형의 PTM의 농축은 PTM의 이러한 누화를 놓칠 수 있습니다. PTM 누화는 단백질 글리코실화와 인산화 사이에서 관찰되었으며, 인간 단백질에서 가장 일반적인 두 가지 PTM과 질량 분광법 워크 플로우를 사용하여 가장 많이 연구 된 두 가지 PTM입니다. 본원에 기재된 동시 농축 전략을 사용하여, 두 PTM 모두 사후 인간 췌장 조직, 복잡한 생물학적 매트릭스로부터 농축된다. 이중 작용성 Ti(IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피는 편리한 스핀 팁 기반 방법으로 여러 분획에서 다양한 형태의 글리코실화 및 인산화를 동시에 분리하는 데 사용되므로 잠재적인 PTM 누화 상호작용의 다운스트림 분석이 가능합니다. 글리코 및 포스포펩타이드에 대한 이러한 농축 워크플로우는 다양한 샘플 유형에 적용되어 여러 PTM의 심층 프로파일링을 달성하고 향후 연구를 위한 잠재적 표적 분자를 식별할 수 있습니다.

서론

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단백질 번역 후 변형 (PTM)은 단백질 구조와 결과적으로 기능 및 하류 생물학적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 인간 프로테옴의 다양성은 다양한 PTM에 의해 제공되는 조합 변동성으로 인해 기하 급수적으로 증가합니다. 게놈에 의해 예측 된 바와 같이 정준 서열로부터의 단백질의 다른 변이체는 프로테오폼으로 알려져 있으며, 많은 프로테오형은 PTMs1에서 발생합니다. 건강과 질병의 프로테오폼 다양성을 연구하는 것은 최근 몇 년 동안 큰 관심의 연구 분야가되었습니다 2,3.

더 깊은 깊이를 가진 프로테오폼 및 보다 구체적으로 PTM에 대한 연구는 질량 분광분석법(MS) 기반 프로테오믹스 방법의 개발을 통해 더욱 용이해졌다. MS를 사용하여, 분석물은 이온화되고, 단편화되고, 단편화되고, 단편의 m/z 에 기초하여 식별된다. 농축 방법은 종종 단백질의 비 변형 형태에 비해 PTM의 상대적 풍부도가 낮기 때문에 필요합니다. 하향식 분석이라고 불리는 손상되지 않은 단백질과 PTM의 분석이 더욱 일상화되었지만, 단백질의 효소 소화와 상향식 분석에서 구성 요소 펩티드의 분석은 여전히 ....

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프로토콜

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고인의 다음 친족으로부터 연구를 위해 췌장 조직을 사용하는 것에 대한 동의가 얻어졌으며 위스콘신-매디슨 대학 건강 과학 기관 검토위원회의 승인을 받았다. IRB 감독은 45 CFR 46.102 (f)에 의해 인정 된 인간 피험자를 포함하지 않기 때문에 필요하지 않습니다.

주의: 산(포름, 아세틱, 트리플루오로아세트산), 염기(수산화암모늄) 및 저온(액체 질소)을 포함하는 이 프로토콜에 사용되는 시약을 취급할 때는 주의해야 합니다. 관련 위험 및 필요한 예방 조치에 익숙해지는 데 사용되는 시약에 대한 안전 데이터 시트를 읽으십시오. 백분율을 사용하여 표시된 농도는 부피 / 총 부피 (v / v)이며 물로 희석됩니다.

1. 조직 냉동 분쇄, 용해 및 단백질 추출

  1. 액체 질소로 탈전을 채 웁니다. 췌장 조직과 접촉 할 조직 분쇄기의 부분, 즉 챔버, 분쇄기 및 회수 스푼을 폴리스티렌 용기에 미리 식히십시오.
  2. 냉동 조직 조각을 미리 냉각 된 샘플 홀더로 옮기고 한 스푼의 액체 질소를 조직에 첨가하십시오.
  3. 분쇄기를 챔버에 넣고 다섯 번에서 열 번 망치를 사용하여 샘플을 분쇄하십시오. 챔버에서 분쇄기를 제거하고 부착 된 조....

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결과

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원시 파일 및 검색 결과를 포함한 대표적인 질량 분석 데이터는 데이터 세트 식별자 PXD03306522가 있는 PRIDE 파트너 리포지토리를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 보관되었습니다.

이 작업에서, 각각의 농축 용리에 대해 중복 주입 반복실험이 분석되었다. 두 기술 반복실험에서 이루어진 식별은 최종 분석에서 대조되었습니다. MS/MS 단편화를 위한 펩티드 전구체를 선별할 때 데이터 의존적 획득의 반확률적 특성으로 인해, 기술적 중복들 사이에서 약 70%-80%의 식별 중첩이 예상된다. 이러한 방법을 사용하는 응용 프로그램에서는 적어도 두 개의 기술적 반복실험이 권장됩니다. 다운스트림 통계 분석의 경우, 다양한 실험 조건에 대한 생물학적 반복실험을 고려해야 합니다. 데이터 보고를 위한 원하는 엄격성에 따라, 보고될 식별, 예를 들어, 적어도 x 개수의 기술적 또는 생물학적 반복실험에서의 식.......

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토론

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이중 기능적 Ti(IV)-IMAC 전략은 단일 샘플 준비 워크플로우에서 동일한 샘플의 N-글리코펩티드와 포스포펩티드를 동시에 분석하는 데 유용합니다. ERLIC 기반 방법은 또한 PTM의 동시 농축을 수행하는 것으로 나타났습니다. 두 전략 모두 이전에 PTM 분석14,18에서 심층적 인 커버리지를 위해 사용되었습니다. 스핀 팁을 사용하여 샘플 인큐베이션 시간을 줄이기 위해 이중 Ti 방법을 적용 할 때,이 프로토콜이 자원 집약적 인 것이 줄어들어 더 널리 접근 할 수 있기를 바랍니다.

여러 PTM의 동시 분석은 농축 물질 표면의 분석물과 작용기 간의 상승 작용을 통해 달성됩니다. 스핀-팁솜으로 처음 패킹할 때, HILIC 모드에서의 글리코펩티드의 보유는 셀룰로스24 상의 히드록실기의 유병률로 인해 증가된다. 물과 아세토니트릴 (수혼화.......

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공개 사항

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저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 및 R21AG065728) 및 청소년 당뇨병 연구 재단 (1-PNF-2016-250-S-B 및 SRA-2016-168-S-B)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 여기에 제시된 데이터는 위스콘신 대학교 임상 및 번역 연구 연구소를 통해 NIH / NCATS UL1TR002373 어워드의 지원을 통해 부분적으로 획득되었습니다. Orbitrap 장비는 NIH 공유 기기 보조금 (NIH-NCRR S10RR029531)과 위스콘신-매디슨 대학의 연구 및 대학원 교육 부총장 사무실의 지원을 통해 구입되었습니다. 우리는 또한 연구를 위해 인간의 췌장을 제공 한 위스콘신 대학 장기 및 조직 기증기구의 관대 한 지원과 Dan Tremmel, Sara D. Sackett 박사 및 Jon Odorico 교수의 도움을 받아 실험실에 샘플을 제공 한 것을 인정하고 싶습니다. 우리 연구팀은이 연구를 위해 조직을 기증 한 가족에게 특별한 감사를하고 싶습니다. L.L.은 위스콘신 대학 카르본 암 센터 (233-AAI9632)의 췌장암 파일럿 보조금 인 NIH 보조금 S10OD025084와 Vilas Distinguished Achievement Professorship 및 Charles Melbourne Johnson Disti....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산, 빙하 (ACS 인증)Fisher ScientificA38S-500
아세톤 (ACS 인증)Fisher ScientificA18-1
아세토니트릴, 옵티마 LC/MS 등급Fisher ScientificA955-4
아세트산 암모늄 (결정질/ACS 인증)Fisher ScientificA637-500
수산화암모늄 (ACS Plus 인증)Fisher ScientificA669-212
Byonic 소프트웨어Protein Metrics해당 없음당단백질체학 분석에 사용되는 상용 소프트웨어(https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH 재료Waters186002353컬럼에서 제거하고 나노 모세혈관을 포장하는 데 사용되는 재료(기기 입구와 직접 정렬하여 사용되는 팁을 통합하기 위해 당겨짐)
CAE-Ti-IMAC, 100%J& K Scientific2749380-1G이중 기능 Ti(IV)-IMAC에 사용되는 재료; 기존 IMAC/기존 인산펩타이드 농축에도 사용 가능
Cellcrusher kit Cellcrusher n/a추출 전에 조직 시료를 분말로 분쇄하는 데 사용
Eppendorf 5424R MicrocentrifugeFisher Scientific05-401-205온도 제어 원심분리용
cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일 정제Sigma11697498001
DTT, 분자 등급(DL-Dithiothreitol)PromegaV3151단백질 환원제
에탄올, 200프루프(100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand 아날로그 볼텍스 믹서Fisher Scientific02-215-414
Fisherbrand 저보유 마이크로 원심분리기 튜브(1.5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand 저잔류 마이크로 원심분리기 튜브(2mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand 모델 120 음파 분석기Fisher ScientificFB120110초음파를 사용한 시료 용해용
포름산, 99.0+%, Optima LC/MS 등급Fisher ScientificA117-50
용융 실리카 모세관 (75 μ m 내경, 360 & m 외경)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375통합 이미터가 있는 사내 풀링 및 패킹 컬럼용
불화수소산(H2O에서 48wt.%)Sigma-Aldrich339261-100ML인발모세관 컬럼
Iodoacetamide, BioUltraSigma I1149-5G단백질 환원 시약
MaxQuant 소프트웨어의n/a인산염 분석에 사용되는 무료 소프트웨어 (https://www.maxquant.org/)
가열 및 냉각 기능이 있는 다중 열 셰이커벤치마크 과학H5000-HC가열 블록
오아시스 HLB 1 cc Vac 카트리지, 10 mg 흡착제 카트리지, 30 &마이크로; m, 100/pkWaters186000383트립틱 분해를 위한 대규모 카트리지 탈염(각각 약 최대 1mg의 로딩 용량)
OMIX C18 피펫 팁, 100 &마이크로; L 팁, 10 - 100 μ L 용리 용량, 1 x 96 팁AgilentA57003100농축 용리를 위한 탈염을 위한 소형 패킹 피펫 팁
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000/FLC-MS
PhosSTOP 인산가수분해효소 억제제 정제4906845001
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher Scientific23225
Pierce 정량 비색 펩타이드 분석Thermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μ m, 기공 크기 300 Å)PolyLCBMSX1203ERLIC/기존 글리코펩타이드 농축에 사용되는 강력한 음이온 교환 크로마토그래피용 재료
인산칼륨 일염기성(결정질/인증 ACS)Fisher ScientificP285-500
자기 교반판이 통합된 압력 주입 셀Next AdvancePC77-MAG최대 2500psi 한계
의 고정상으로 나노 모세관 컬럼 패킹용Proteome Discoverer 소프트웨어Thermo Fisher Scientific해당 없음단백질체학 분석(통합 데이터베이스 검색 소프트웨어 노드 포함) 및 데이터 시각화(https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)를 위한 상용 소프트웨어
SpeedVac SC110 진공 농축기 모델 SC110-120Savantn/a시료 건조용 원심 진공 농축기(열하)
SDS 용액, 10% 도데실황산나트륨 용액, 분자생물학/전기영동Fisher ScientificBP2436200
염기서열분석 등급 변형 트립신프로메가V5111
염화나트륨(결정질/인증 ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, 비어 있음, 10-200 &마이크로; L, 96Glygen CorporationTT2EMT.96농축을 위한 크로마토그래피 재료를 포장하는 데 사용할 수 있는 미크론 크기의 구멍이 있는 빈 피펫 팁, 튜브 어댑터와 함께 번들
트리에틸암모늄 바이카보네이트 버퍼(TEAB, 1M, pH 8.5(휘발성))Sigma90360-100ML
트리플루오로아세트산, 시약 등급, 99%Fisher Scientific60-017-61
트리스 베이스(백색 결정 또는 결정성 분말/분자생물학)Fisher ScientificBP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5071
Urea (Certified ACS)Fisher ScientificU15-500
Water, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64
이미터를 여는 데 사용됩니다.용 풀링 나노 캐필러리 컬럼 Sigma

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
  2. Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22

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