방법 논문

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

DOI:

10.3791/63735

⸱

2022년 5월 4일

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질량 분광법은 번역 후 변형 (PTM)에 대한 깊은 범위를 제공 할 수 있지만, 복잡한 생물학적 매트릭스로부터의 이러한 변형의 농축은 종종 비 변형 된 분석물에 비해 낮은 화학량론으로 인해 필요합니다. 상향식 프로테오믹스 워크플로우에서 펩티드에 대한 PTM의 대부분의 농축 워크플로우는 생성된 펩티드가 분석되기 전에 단백질이 효소적으로 소화되고, 오직 한 가지 유형의 변형만을 풍부하게 한다. 그러나 PTM의 전체 보완은 생물학적 기능을 유도하고 단일 유형의 PTM의 농축은 PTM의 이러한 누화를 놓칠 수 있습니다. PTM 누화는 단백질 글리코실화와 인산화 사이에서 관찰되었으며, 인간 단백질에서 가장 일반적인 두 가지 PTM과 질량 분광법 워크 플로우를 사용하여 가장 많이 연구 된 두 가지 PTM입니다. 본원에 기재된 동시 농축 전략을 사용하여, 두 PTM 모두 사후 인간 췌장 조직, 복잡한 생물학적 매트릭스로부터 농축된다. 이중 작용성 Ti(IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피는 편리한 스핀 팁 기반 방법으로 여러 분획에서 다양한 형태의 글리코실화 및 인산화를 동시에 분리하는 데 사용되므로 잠재적인 PTM 누화 상호작용의 다운스트림 분석이 가능합니다. 글리코 및 포스포펩타이드에 대한 이러한 농축 워크플로우는 다양한 샘플 유형에 적용되어 여러 PTM의 심층 프로파일링을 달성하고 향후 연구를 위한 잠재적 표적 분자를 식별할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 번역 후 변형 (PTM)은 단백질 구조와 결과적으로 기능 및 하류 생물학적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 인간 프로테옴의 다양성은 다양한 PTM에 의해 제공되는 조합 변동성으로 인해 기하 급수적으로 증가합니다. 게놈에 의해 예측 된 바와 같이 정준 서열로부터의 단백질의 다른 변이체는 프로테오폼으로 알려져 있으며, 많은 프로테오형은 PTMs1에서 발생합니다. 건강과 질병의 프로테오폼 다양성을 연구하는 것은 최근 몇 년 동안 큰 관심의 연구 분야가되었습니다 2,3.

더 깊은 깊이를 가진 프로테오폼 및 보다 구체적으로 PTM에 대한 연구는 질량 분광분석법(MS) 기반 프로테오믹스 방법의 개발을 통해 더욱 용이해졌다. MS를 사용하여, 분석물은 이온화되고, 단편화되고, 단편화되고, 단편의 m/z 에 기초하여 식별된다. 농축 방법은 종종 단백질의 비 변형 형태에 비해 PTM의 상대적 풍부도가 낮기 때문에 필요합니다. 하향식 분석이라고 불리는 손상되지 않은 단백질과 PTM의 분석이 더욱 일상화되었지만, 단백질의 효소 소화와 상향식 분석에서 구성 요소 펩티드의 분석은 여전히 PTM 분석에 가장 널리 사용되는 경로입니다. 가장 널리 연구된 두 개의 PTM과 생체내에서 가장 흔한 두 개의 PTM은 글리코실화와 인산화4이다. 이 두 PTM은 세포 신호 전달 및 인식에 중요한 역할을하므로 질병 연구에서 특성화하는 중요한 변형입니다.

다양한 PTM의 화학적 특성은 종종 분석 전에 단백질 및 펩티드 수준에서 이러한 PTM을 농축하는 경로를 제공합니다. 글리코실화는 각 단당류에 히드록실기가 풍부하기 때문에 친수성 PTM이다. 이러한 특성은 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)에서 글리코펩티드를 풍부하게 하는데 사용될 수 있으며, 이는 소수성 비변형된 펩티드5로부터 더 친수성 글리코펩티드를 분리할 수 있다. 인산화는 산성 pH를 제외하고 음전하를 띤 포스페이트 모이어티를 추가한다. 이러한 전하로 인해 티타늄을 포함한 다양한 금속 양이온을 사용하여 포스포 펩타이드를 유인하고 결합 할 수 있으며 비 인산화 된 종은 씻겨 나갈 수 있습니다. 이것은 고정화 된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)의 원리입니다. 글리코실화 및 인산화를 위한 이들 및 다른 농축 전략에 대한 추가 논의는 최근 리뷰 6,7에서 찾을 수 있다.

비교적 많은 양의 출발 펩티드 물질 (0.5 mg 이상)은 펩티드 상의 PTMs의 낮은 화학량론으로 인해 농축 프로토콜에 종종 필요하다. 종양 코어 생검 또는 뇌척수액 분석과 같이 이러한 양의 샘플을 쉽게 얻을 수 없는 시나리오에서는 최대 생체 분자 정보를 생성하는 facile 워크플로우를 사용하는 것이 좋습니다. 우리 연구실과 다른 사람들이 개발 한 최근의 전략은 동일한 PTM 농축 워크 플로 8,9,10,11,12를 사용하여 글리코실화 및 인산화의 동시 및 병렬 분석을 강조했습니다. 이 두 PTM의 화학적 특성은 다를 수 있지만 이러한 PTM은 혁신적인 분리 기술 및 사용 된 재료로 인해 여러 단계로 분석 될 수 있습니다. 예를 들어, 정전기 반발-친수성 상호작용 크로마토그래피(ERLIC)는 분석물과 이동상 사이의 친수성 상호작용에 기초한 분리를 분석물과 고정상 물질 사이의 전하-전하 상호작용(13,14,15,16)에 기초하여 분리를 오버레이한다. 산성 pH에서, 고정상으로의 인산화된 펩티드의 인력은 그들의 보유 및 비변형된 펩티드로부터의 분리를 향상시킬 수 있다. 친수성 미소 구체 상에 고정화된 Ti(IV)로 구성된 물질은 포스포펩티드와 중성, 산성 및 만노스-6-인산화된 글리코펩티드17,18을 분리하기 위해 HILIC 및 IMAC 기반 용출에 사용될 수 있다. 이 전략은 이중 기능 Ti(IV)-IMAC로 알려져 있습니다. 단일 워크플로우에서 여러 PTM을 보강하기 위해 이러한 전략을 사용하면 잠재적인 PTM 누화 상호 작용에 대한 분석에 더 쉽게 액세스할 수 있습니다. 추가적으로, 총 샘플 양 및 시간 요건은 병렬로 수행될 때 종래의 농축 방법(즉, 개별 샘플 분취량 상의 HILIC 및 IMAC)보다 작다.

단백질 글리코실화 및 인산화의 동시 분석을 위한 이중 기능적 Ti(IV)-IMAC 전략을 입증하기 위해, 우리는 사후 인간 췌장 조직을 분석하기 위해 이를 적용했습니다. 췌장은 인슐린과 글루카곤을 포함한 소화 효소와 조절 호르몬을 모두 생산합니다. 췌장 기능은 췌장 질환에서 손상됩니다. 당뇨병에서는 혈당 조절이 영향을 받아 혈액 내 포도당 수치가 높아집니다. 췌장염에서 염증은 장기의 자동 소화로 인해 발생합니다3. 글리코실화 및 인산화를 포함한 PTM 프로파일의 변화는 종종 그렇듯이 다른 질병에서 발생할 수 있습니다.

여기에서는 췌장 조직에서 추출한 단백질로부터 유래된 N-글리코펩티드 및 포스포펩티드에 대한 이중 기능성 Ti(IV)-IMAC 전략에 기초한 스핀팁 기반 동시 농축 방법에 대한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 단백질 추출 및 소화, 농축, MS 데이터 수집 및 데이터 처리를 포함한다. 이 연구의 대표적인 데이터는 식별자 PXD033065를 가진 ProteomeXchange 컨소시엄을 통해 구할 수 있습니다.

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그림 1: 인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드를 동시에 분석하기 위한 워크플로우. 조직은 먼저 세제 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 사용하여 단백질 추출 전에 미세한 분말로 분쇄된다. 그런 다음 단백질은 효소 소화를 받는다. 생성된 펩티드는 이중 작용성 Ti(IV)-IMAC를 사용하여 농축하기 전에 분취된다. 원시 데이터는 나노 스케일 역상 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법 (nRPLC-MS)을 사용하여 수집되며 데이터베이스 검색 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜은 PTM 분석의 접근성을 높이고 동일한 워크플로우에서 여러 PTM을 보다 광범위하게 분석할 수 있도록 하기 위한 것입니다. 이 프로토콜은 세포 및 생체유체를 포함한 다른 복잡한 생물학적 매트릭스에 적용될 수 있다.

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프로토콜

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고인의 다음 친족으로부터 연구를 위해 췌장 조직을 사용하는 것에 대한 동의가 얻어졌으며 위스콘신-매디슨 대학 건강 과학 기관 검토위원회의 승인을 받았다. IRB 감독은 45 CFR 46.102 (f)에 의해 인정 된 인간 피험자를 포함하지 않기 때문에 필요하지 않습니다.

주의: 산(포름, 아세틱, 트리플루오로아세트산), 염기(수산화암모늄) 및 저온(액체 질소)을 포함하는 이 프로토콜에 사용되는 시약을 취급할 때는 주의해야 합니다. 관련 위험 및 필요한 예방 조치에 익숙해지는 데 사용되는 시약에 대한 안전 데이터 시트를 읽으십시오. 백분율을 사용하여 표시된 농도는 부피 / 총 부피 (v / v)이며 물로 희석됩니다.

1. 조직 냉동 분쇄, 용해 및 단백질 추출

  1. 액체 질소로 탈전을 채 웁니다. 췌장 조직과 접촉 할 조직 분쇄기의 부분, 즉 챔버, 분쇄기 및 회수 스푼을 폴리스티렌 용기에 미리 식히십시오.
  2. 냉동 조직 조각을 미리 냉각 된 샘플 홀더로 옮기고 한 스푼의 액체 질소를 조직에 첨가하십시오.
  3. 분쇄기를 챔버에 넣고 다섯 번에서 열 번 망치를 사용하여 샘플을 분쇄하십시오. 챔버에서 분쇄기를 제거하고 부착 된 조직 분말과 조각을 긁어 내십시오.
  4. 조직이 녹기 시작하면 한 숟가락의 액체 질소를 챔버에 넣으십시오. 샘플이 큰 조직 덩어리가없는 미세 분말이 될 때까지 분쇄 과정을 반복하십시오. 샘플을 약 100mg 분취량으로 미리 냉각된 튜브에 분담한다.
  5. 4% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 150 mM NaCl 및 25 mM 트리스(pH = 7.4)를 함유하는 용해 완충액을 준비한다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제 각각을 500 μL의 물에 각각 하나의 정제를 20x 스톡에 용해시킨다. 최종 1x 농도를 위해 용해 완충액에 각 억제제의 20x 스톡의 필요한 부피를 첨가한다.
  6. 조직 100 mg 당 600 μL의 용해 완충액을 튜브에 첨가하고, 800 rpm에서 진탕하면서 10분 동안 가열 블록에서 95°C에서 인큐베이션한다. 가열 블록에서 샘플을 제거하고 실온으로 식히십시오.
  7. 60W 에너지(20kHz)에서 45초 동안 샘플을 초음파 처리하고, 그 사이에 30초 동안 15s 펄스를 사용합니다. 샘플을 4°C에서 15분 동안 3,000 x g 에서 펠릿화한다.
  8. 상청액을 50% 아세톤, 49.9% 에탄올 및 0.1% 아세트산을 함유하는 침전 용매 1.5 mL에 용해 완충액 300 μL의 5x 침전 용매에 첨가한다. -20°C에서 하룻밤 동안 식힌다.
  9. 샘플을 다시 3,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 펠릿화하고 상청액을 제거하였다. 주걱으로 분해하고 동일한 양의 침전 용매와 혼합하여 펠렛을 세척한다. 펠릿을 다시 2x 세척 단계를 반복한다.
  10. 샘플을 4°C에서 15분 동안 16,000 x g 에서 펠릿화하였다. 샘플 펠릿을 흄 후드에서 15분 동안 공기 건조시키고 진행될 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관한다.

2. 단백질 소화 및 탈염

  1. 단백질 펠릿을 50 mM 트리에틸암모늄 중탄산염(TEAB) 및 8 M 우레아를 함유하는 갓 만든 소화 완충액 300 μL에 재현탁시킨다.
  2. 제조자의 프로토콜에 따라 단백질 분석을 사용하여 용액의 단백질 농도를 추정한다.
  3. 용액 중의 단백질에 디티오트레이톨 (DTT)을 최종 농도 5 mM로 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 1 h 동안 감소시킨다. 이어서, 요오도아세트아미드 (IAA)를 최종 농도 15 mM로 첨가하고, 어둠 속에서 30분 동안 실온에서 알킬레이트를 혼합하고, 알킬레이트한다. DTT의 첨가를 이전과 동일한 부피로 반복함으로써 알킬화를 켄칭하고 혼합한다.
  4. 1:100 효소:단백질 비율에서 LysC/트립신을 첨가하고, 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 1 M을 <하기 위해 사용된 8 M 우레아를 희석하기 위해 50 mM TEAB를 첨가한다. 1:100 효소:단백질 비로 트립신을 첨가하고, 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
  5. 트리플루오로아세트산 (TFA)을 0.3 % v / v로 첨가하여 소화를 진정시킵니다. 시작 단백질 1mg마다 탈염 카트리지(1cc, 10mg)를 1mL의 아세토니트릴(ACN)과 1mL의 0.1% TFA로 3x를 컨디셔닝합니다.
  6. 소화된 혼합물을 탈염 카트리지 상에 로딩한다. 혼합물을 0.1% TFA 1 mL를 사용하여 3x 세척한다. 용출이 느린 경우 양압을 가하되 초당 한 방울> 유속을 피하십시오.
  7. 1 mL의 60% ACN 및 0.1% 포름산(FA) 용액을 사용하는 엘루트 펩티드. 용출된 펩티드를 용매가 완전히 증발될 때까지 원심 진공 농축기를 사용하여 대략 35°C에서 건조시킨다.
  8. 펩티드를 300 μL의 물에 재현탁시키고 제조자의 프로토콜에 따라 펩티드 검정을 사용하여 펩티드 농도를 추정한다. 펩티드를 500 μg 분취량으로 분할하고 완전히 건조시킨다.

3. ERLIC N-글리코펩티드 농축

참고: 정확한 원심분리 속도와 시간은 샘플에 따라 다를 수 있으므로 최적화해야 합니다. 일반적으로, 2분 동안 300 x g는 물질의 컨디셔닝 및 세척에 적합하고, 용출을 위해 5분 동안 100 x g이다.

  1. 면봉의 약 3mg의 무게를 측정하여 빈 200μL 피펫 팁에 포장하십시오 (스핀 팁, 재료 표 참조).
  2. 강한 음이온 교환 농축 물질을 튜브로 옮기고 재료 10mg 당 0.1 % TFA 200 μL를 첨가하십시오. 500 μg의 펩티드를 농축하려면 15mg의 물질을 사용하십시오. 15 분 동안 흔들어서 재료를 활성화하십시오.
  3. 튜브 어댑터를 사용하여 스핀 팁을 2mL 튜브 위에 놓고 15mg의 재료를 팁에 충분한 슬러리를 첨가하십시오. 벤치탑 원심분리기에서 회전하여 액체를 제거하십시오.
  4. 200 μL의 ACN으로 3x를 원심분리하여 물질을 컨디셔닝한다. 100 mM 아세트산암모늄 (NH4Ac), 1% TFA 및 80% ACN/0.1% TFA (로딩 완충액)를 사용하여 삼중 컨디셔닝을 반복한다.
  5. 500 μg 펩티드 샘플을 대략 200 μL의 로딩 완충액에 재현탁시키고 스핀-팁을 통해 유동시킨다. 완전한 바인딩을 보장하기 위해 플로우 스루 2x를 다시 로드하십시오.
  6. 200 μL의 80% ACN/0.1% TFA를 사용하여 5x를 원심분리한 다음, 80% ACN/0.1% FA의 200 μL를 사용하여 2x 원심분리하여 물질을 세척한다.
  7. 다음의 각각을 200 μL로 원심분리하여 펩티드를 희석한다: 50% ACN/0.1% FA (E1); 0.1% FA (E2); 0.1% TFA (E3); 300 mMKH2PO4, 10% ACN (E4).
  8. 2x를 80% ACN/5%NH4OH의 200 μL로 원심분리하여 물질을 세척한다. 나머지 펩티드를 200 μL의 10%NH4OH(E5)로 희석한다.
  9. 모든 용출액을 대략 35°C에서 원심 진공 농축기를 사용하여 완전히 건조시킨다.
  10. 제조업체의 프로토콜에 따라 탈염 팁을 사용하여 기본 용출 (E5)의 탈염을 수행하십시오.
  11. 탈염 팁으로부터의 용출을 대략 35°C에서 원심 진공 농축기를 사용하여 완전성으로 건조시킨다.

4. Ti(IV)-IMAC 포스포펩타이드 농축

참고: 정확한 원심분리 속도와 시간은 샘플에 따라 다를 수 있으므로 최적화해야 합니다. 일반적으로, 2분 동안 300 x g는 물질의 컨디셔닝 및 세척에 적합하고, 용출을 위해 5분 동안 100 x g이다.

  1. 면봉의 무게를 약 3mg으로 측정하여 빈 200μL 피펫 팁(스핀 팁)에 포장합니다.
  2. Ti-IMAC 포스포펩티드 농축 물질을 튜브로 옮기고 물질 10mg 당 0.1% TFA 200μL를 첨가한다. 500 μg 펩티드를 농축하려면 10mg의 물질을 사용하십시오.
  3. 튜브 어댑터를 사용하여 스핀 팁을 2mL 튜브 위에 놓고 10mg 재료의 팁에 충분한 슬러리를 추가합니다. 벤치탑 원심분리기에서 회전하여 액체를 제거하십시오.
  4. 상기 기재된 바와 동일한 원심분리 설정을 사용하여 200 μL의 40% ACN/3% TFA로 물질을 컨디셔닝한다. 펩티드 샘플을 40% ACN/3% TFA의 200 μL에 재현탁시키고 스핀 팁을 통해 유동시킨다. 흐름 스루를 두 번 다시 로드하여 보다 완벽한 바인딩을 보장합니다.
  5. 200 μL의 50% ACN, 6% TFA 및 200 mM NaCl 용액으로 원심분리하여 물질을 세척하고, 이어서 200 μL의 30% ACN 및 0.1% TFA 용액에서 2x 세척하였다.
  6. 200 μL의 10%NH4OH를 갖는 에루트 펩티드. 용출을 진공 하에서 완전히 건조시킵니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 탈염 팁을 사용하여 탈염을 수행하십시오. 탈염 팁에서 용출을 진공 하에서 완전성으로 건조시킵니다.

5. 이중 기능 Ti (IV) 동시 농축

참고: 정확한 원심분리 속도와 시간은 샘플에 따라 다를 수 있으므로 최적화해야 합니다. 일반적으로, 2분 동안 300 x g는 물질의 컨디셔닝 및 세척에 적합하고, 용출을 위해 5분 동안 100 x g이다.

  1. 면봉의 무게는 약 3mg이며 빈 스핀 팁에 포장하십시오.
  2. 약 1g의 Ti(IV)-IMAC 물질을 튜브에 옮깁니다. 0.1% TFA를 공지된 농도의 물질, 예를 들어 20 mg/200 μL에 첨가한다(물질은 4°C에서 이 현탁액에 저장될 수 있다).
  3. 500 μg 펩티드로부터 농축을 위해, 20 mg의 물질을 옮기기 위해 스핀 팁에 충분한 슬러리를 첨가한다. 스핀-팁을 0.1% TFA의 200 μL로 원심분리하여 세척한다.
  4. 샘플을 200μL의 로딩/세척 용매(80% ACN 및 3% TFA)에 재현탁하고 스핀 팁을 통해 흐릅니다. 플로우 스루 2x를 다시로드하십시오.
  5. 200 μL의 로딩/세척 용매로 원심분리하여 스핀 팁 6x를 세척하십시오. 스핀 팁을 80% ACN/0.1% FA 용액 200μL로 세척한다.
  6. 펩티드를 다음의 각각인 200 μL로 희석한다: 60% ACN/0.1% FA (E1) 및 40% ACN/0.1% FA (E2). 각 용출을 개별적으로 분석하십시오.
  7. 펩티드를 각각 200 μL로 희석한다: 20% ACN/0.1% FA 및 0.1% FA. 두 용출액을 결합하고 하나의 샘플(E3)로 분석한다.
  8. 펩티드를 200 μL의 다음 각각으로 희석한다: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; 및 30 % ACN / 0.1 % TFA. 이러한 용출을 결합하고 패킹된 팁을 사용하여 탈염한 후 하나(E4)로서 분석한다.
  9. 물질을 3x에 대해 90% ACN/2.5%NH4OH의 200 μL를 사용하여 염기성 pH로 조건화한다. 이 세척은 버리십시오.
  10. 펩티드를 다음의 각각: 60% ACN/10% NH4OH (E5) 및40% ACN/10%NH4OH(E6) 중 200 μL로 분리한다. 포장 된 팁을 사용하여 탈염 한 후 이러한 용출을 별도로 분석하십시오.
  11. 펩티드를 각각 200 μL로 희석한다: 20% ACN/10%NH4OH; 10% ACN/10%NH4OH; 및 10%NH4OH. 이러한 용출을 결합하고 패킹된 팁을 사용하여 탈염 후 하나(E7)로서 분석한다.
  12. 모든 용출액을 진공 하에서 완전히 건조시킵니다.

6. 나노 흐름 역상 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법 (nRPLC-MS)

참고: MS 데이터 수집 및 분석 방법은 다양하므로 제안된 LC-MS 파이프라인(및 관련 파라미터)은 다음 단계에서 하나만 여기에 설명되어 있습니다. 이전에 요약된 샘플 준비 및 농축 단계를 사용하여 생성된 샘플은 충분한 데이터 품질이 주어지면 상업적으로 이용가능한 크로마토그래피 컬럼을 사용하는 것을 포함하여 다른 도구적 셋업을 사용하여 분석될 수 있다.

  1. 19에 기재된 바와 같이 C18 재료를 사용하여 15 cm 길이의 모세관(75 μm 내경)을 당겨서 포장한다. 이동상 A(물 중 0.1% FA) 및 이동상 B(ACN에서 0.1% FA)를 준비합니다.
  2. 농축된 펩티드 샘플을 15 μL의 3% 이동상 B. 2 μL의 샘플(∼13% 샘플 부피)을 컬럼 상에 직접 재구성한다. 기술 복제본으로 각 샘플을 분석합니다.
  3. 0.3 μL/min의 유속으로 90분에 걸쳐 3% 내지 30% 이동상 B의 구배를 사용하는 Elute 펩티드. 컬럼을 8분 동안 75% B를 사용하여 세척한 다음, 8분 동안 95% B로 세척하고, 12분 동안 3% B에서 평형화로 방법을 마무리하였다.
  4. 다음 파라미터로 상위 20개 피크의 데이터 의존적 수집을 사용하여 포지티브 이온 모드에서 질량 분광계를 작동시킨다: 스프레이 전압 2kV; 120,000 분해능에서 400-2,000 m/z에서 LC/MS에서 MS 1 검출, 2E5 자동 이득 제어(AGC) 타겟, 100ms 최대 주입 시간, 30% RF 렌즈, 1.6 m/z 윈도우를 갖는 사중극자 절연, 충전 상태 2-8 및 미결정, 30초 동적 배제; LC/MS에서 MS 2 검출은 22%, 30% 및 38%의 계단식 HCD 단편화를 사용하고, 30,000 분해능에서 첫 번째 질량 120m/z를 고정하고, 5E4 AGC 타겟 및 2.5E4 최소 강도 요구 사항에서 고정했습니다.

7. MS 데이터 분석

참고: 두 개의 서로 다른 소프트웨어를 사용하여 동일한 데이터 세트를 분석하는 하나의 데이터 분석 파이프라인이 여기에 나와 있습니다. 인산화 및 글리코실화는 여기에 설명된 바와 같이 두 개의 개별 소프트웨어 대신에 단일 소프트웨어를 사용하여 동시에 검색될 수 있지만, 일반적으로, 소프트웨어 검색 시간은 검색 공간, 즉 고려되는 PTM의 수에 비례한다. 이러한 이유로, 두 개의 상이한 소프트웨어가 글리코펩티드 및 포스포펩티드에 대한 검색과 병행하여 사용된다.

  1. 적절한 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터 파일을 처리합니다( 자료 표 참조).
    1. UniProt 인간 (또는 적절한 종 별) 데이터베이스에 대한 스펙트럼을 검색하십시오. Cys의 카르바미도메틸화를 고정된 변형으로 설정한다. 누락된 효소 절단의 최대 수를 두 개로 설정합니다.
  2. 원시 데이터 파일에서, 상용 소프트웨어( 표 참조)를 사용하여, 분석될 글리코펩티드를 검색한다(20). 네 개의 잔기의 최소 펩티드 길이를 갖는 10ppm 전구체 질량 공차 및 0.01 Da 단편 질량 허용오차를 사용한다.
    1. HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) 및 HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1)를 포함한 일반적인 만노스-6-포스페이트(M6P)글리칸으로 확장된 소프트웨어 임베디드 N-글리칸 데이터베이스를 사용하여 검색합니다.
    2. N-글리코실화를 일반적인 변형으로 설정한다. 펩티드 스펙트럼 매치 (PSM) 당 최대 총 변형을 하나의 공통 및 두 개의 희귀 한 것으로 설정하십시오.
    3. 다음과 같은 변수 변형을 설정하십시오 : Met의 산화 (드물게), Asn 및 Gln에서의 탈아미드화 (드물게), Ser, Thr 및 Tyr (공통)에서의 인산화. 다음 식별 필터를 설정합니다: 점수 컷오프 > 150, |log prob| > 1, 델타 모드 점수> 10입니다.
    4. 단백질 및 펩티드 그룹 탭에서 검색 결과를 내보내고 분석합니다.
    5. MS/MS 스펙트럼에서 PhosphoHex 옥소늄 이온( 243m/z)의 존재에 대해 M6P 글리칸을 포함하는 식별을 수동으로 스크리닝하고 이 진단 이온을 포함하지 않는 위양성 식별을 제거합니다.
  3. 원시 데이터 파일에서, 오픈 소스 소프트웨어( 표 참조)를 사용하여, 분석될 포스포펩티드를 검색한다(21). 20 ppm 첫 번째 탐색 펩티드 내성 및 4.5 ppm 주 탐색 펩티드 허용오차를 사용한다.
    1. 펩티드당 최대 변형 횟수를 5로 설정한다. PSM 및 단백질 허위 발견률(FDR)을 1%로 설정하고 최소 펩티드 길이를 7개의 잔기로 설정한다.
    2. 가변 변형을 Met에서의 산화, N 말단 단백질 아세틸화 및 Ser, Thr 및 Tyr에서의 인산화로 설정하십시오. modificationSpecificPeptides 파일을 사용하여 검색 결과를 분석합니다.
  4. 단백질, 펩티드 및 변형 부위 수준에서 PTM의 동정 횟수를 결정한다.

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결과

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원시 파일 및 검색 결과를 포함한 대표적인 질량 분석 데이터는 데이터 세트 식별자 PXD03306522가 있는 PRIDE 파트너 리포지토리를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 보관되었습니다.

이 작업에서, 각각의 농축 용리에 대해 중복 주입 반복실험이 분석되었다. 두 기술 반복실험에서 이루어진 식별은 최종 분석에서 대조되었습니다. MS/MS 단편화를 위한 펩티드 전구체를 선별할 때 데이터 의존적 획득의 반확률적 특성으로 인해, 기술적 중복들 사이에서 약 70%-80%의 식별 중첩이 예상된다. 이러한 방법을 사용하는 응용 프로그램에서는 적어도 두 개의 기술적 반복실험이 권장됩니다. 다운스트림 통계 분석의 경우, 다양한 실험 조건에 대한 생물학적 반복실험을 고려해야 합니다. 데이터 보고를 위한 원하는 엄격성에 따라, 보고될 식별, 예를 들어, 적어도 x 개수의 기술적 또는 생물학적 반복실험에서의 식...

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토론

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이중 기능적 Ti(IV)-IMAC 전략은 단일 샘플 준비 워크플로우에서 동일한 샘플의 N-글리코펩티드와 포스포펩티드를 동시에 분석하는 데 유용합니다. ERLIC 기반 방법은 또한 PTM의 동시 농축을 수행하는 것으로 나타났습니다. 두 전략 모두 이전에 PTM 분석14,18에서 심층적 인 커버리지를 위해 사용되었습니다. 스핀 팁을 사용하여 샘플 인큐베이션 시간을 줄이기 위해 이중 Ti 방법을 적용 할 때,이 프로토콜이 자원 집약적 인 것이 줄어들어 더 널리 접근 할 수 있기를 바랍니다.

여러 PTM의 동시 분석은 농축 물질 표면의 분석물과 작용기 간의 상승 작용을 통해 달성됩니다. 스핀-팁솜으로 처음 패킹할 때, HILIC 모드에서의 글리코펩티드의 보유는 셀룰로스24 상의 히드록실기의 유병률로 인해 증가된다. 물과 아세토니트릴 (수혼화...

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공개 사항

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저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 및 R21AG065728) 및 청소년 당뇨병 연구 재단 (1-PNF-2016-250-S-B 및 SRA-2016-168-S-B)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 여기에 제시된 데이터는 위스콘신 대학교 임상 및 번역 연구 연구소를 통해 NIH / NCATS UL1TR002373 어워드의 지원을 통해 부분적으로 획득되었습니다. Orbitrap 장비는 NIH 공유 기기 보조금 (NIH-NCRR S10RR029531)과 위스콘신-매디슨 대학의 연구 및 대학원 교육 부총장 사무실의 지원을 통해 구입되었습니다. 우리는 또한 연구를 위해 인간의 췌장을 제공 한 위스콘신 대학 장기 및 조직 기증기구의 관대 한 지원과 Dan Tremmel, Sara D. Sackett 박사 및 Jon Odorico 교수의 도움을 받아 실험실에 샘플을 제공 한 것을 인정하고 싶습니다. 우리 연구팀은이 연구를 위해 조직을 기증 한 가족에게 특별한 감사를하고 싶습니다. L.L.은 위스콘신 대학 카르본 암 센터 (233-AAI9632)의 췌장암 파일럿 보조금 인 NIH 보조금 S10OD025084와 Vilas Distinguished Achievement Professorship 및 Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산, 빙하 (ACS 인증)Fisher ScientificA38S-500
아세톤 (ACS 인증)Fisher ScientificA18-1
아세토니트릴, 옵티마 LC/MS 등급Fisher ScientificA955-4
아세트산 암모늄 (결정질/ACS 인증)Fisher ScientificA637-500
수산화암모늄 (ACS Plus 인증)Fisher ScientificA669-212
Byonic 소프트웨어Protein Metrics해당 없음당단백질체학 분석에 사용되는 상용 소프트웨어(https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH 재료Waters186002353컬럼에서 제거하고 나노 모세혈관을 포장하는 데 사용되는 재료(기기 입구와 직접 정렬하여 사용되는 팁을 통합하기 위해 당겨짐)
CAE-Ti-IMAC, 100%J& K Scientific2749380-1G이중 기능 Ti(IV)-IMAC에 사용되는 재료; 기존 IMAC/기존 인산펩타이드 농축에도 사용 가능
Cellcrusher kit Cellcrusher n/a추출 전에 조직 시료를 분말로 분쇄하는 데 사용
Eppendorf 5424R MicrocentrifugeFisher Scientific05-401-205온도 제어 원심분리용
cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일 정제Sigma11697498001
DTT, 분자 등급(DL-Dithiothreitol)PromegaV3151단백질 환원제
에탄올, 200프루프(100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand 아날로그 볼텍스 믹서Fisher Scientific02-215-414
Fisherbrand 저보유 마이크로 원심분리기 튜브(1.5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand 저잔류 마이크로 원심분리기 튜브(2mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand 모델 120 음파 분석기Fisher ScientificFB120110초음파를 사용한 시료 용해용
포름산, 99.0+%, Optima LC/MS 등급Fisher ScientificA117-50
용융 실리카 모세관 (75 μ m 내경, 360 & m 외경)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375통합 이미터가 있는 사내 풀링 및 패킹 컬럼용
불화수소산(H2O에서 48wt.%)Sigma-Aldrich339261-100ML인발모세관 컬럼
Iodoacetamide, BioUltraSigma I1149-5G단백질 환원 시약
MaxQuant 소프트웨어의n/a인산염 분석에 사용되는 무료 소프트웨어 (https://www.maxquant.org/)
가열 및 냉각 기능이 있는 다중 열 셰이커벤치마크 과학H5000-HC가열 블록
오아시스 HLB 1 cc Vac 카트리지, 10 mg 흡착제 카트리지, 30 &마이크로; m, 100/pkWaters186000383트립틱 분해를 위한 대규모 카트리지 탈염(각각 약 최대 1mg의 로딩 용량)
OMIX C18 피펫 팁, 100 &마이크로; L 팁, 10 - 100 μ L 용리 용량, 1 x 96 팁AgilentA57003100농축 용리를 위한 탈염을 위한 소형 패킹 피펫 팁
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000/FLC-MS
PhosSTOP 인산가수분해효소 억제제 정제4906845001
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher Scientific23225
Pierce 정량 비색 펩타이드 분석Thermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μ m, 기공 크기 300 Å)PolyLCBMSX1203ERLIC/기존 글리코펩타이드 농축에 사용되는 강력한 음이온 교환 크로마토그래피용 재료
인산칼륨 일염기성(결정질/인증 ACS)Fisher ScientificP285-500
자기 교반판이 통합된 압력 주입 셀Next AdvancePC77-MAG최대 2500psi 한계
의 고정상으로 나노 모세관 컬럼 패킹용Proteome Discoverer 소프트웨어Thermo Fisher Scientific해당 없음단백질체학 분석(통합 데이터베이스 검색 소프트웨어 노드 포함) 및 데이터 시각화(https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)를 위한 상용 소프트웨어
SpeedVac SC110 진공 농축기 모델 SC110-120Savantn/a시료 건조용 원심 진공 농축기(열하)
SDS 용액, 10% 도데실황산나트륨 용액, 분자생물학/전기영동Fisher ScientificBP2436200
염기서열분석 등급 변형 트립신프로메가V5111
염화나트륨(결정질/인증 ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, 비어 있음, 10-200 &마이크로; L, 96Glygen CorporationTT2EMT.96농축을 위한 크로마토그래피 재료를 포장하는 데 사용할 수 있는 미크론 크기의 구멍이 있는 빈 피펫 팁, 튜브 어댑터와 함께 번들
트리에틸암모늄 바이카보네이트 버퍼(TEAB, 1M, pH 8.5(휘발성))Sigma90360-100ML
트리플루오로아세트산, 시약 등급, 99%Fisher Scientific60-017-61
트리스 베이스(백색 결정 또는 결정성 분말/분자생물학)Fisher ScientificBP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5071
Urea (Certified ACS)Fisher ScientificU15-500
Water, Optima LC/MS GradeFisher ScientificW64
이미터를 여는 데 사용됩니다.용 풀링 나노 캐필러리 컬럼 Sigma

참고문헌

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