히알루론산 35kDa가 장내 유래 단분자층을 사용한 조기 소장 손상 및 치유의 시험관 내 모델에 미치는 영향

요약

이 프로토콜은 인간이 아닌 영장류 회장으로부터 분리된 3차원(3D) 엔테로이드로부터 유래된 2차원(2D) 단층에 대한 스크래치 상처 분석을 확립하고 수행하는 방법을 설명한다.

초록

시험관 내 스크래치 상처 분석은 일반적으로 다양한 조직 유형에서 상피 치유의 메커니즘과 특성을 조사하는 데 사용됩니다. 여기에서는 회장의 장 음와에서 유래한 3차원(3D) 비인간 영장류 엔테로이드로부터 2차원(2D) 단층을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 이러한 장내 유래 단분자층을 시험 관 내 스크래치 상처 분석에 활용하여 모유 HA 모방체인 히알루로난 35kDa(HA35)가 상피 상처 가장자리를 따라 세포 이동 및 증식을 촉진하는 능력을 테스트했습니다. 단층이 컨플루언스로 성장한 후 수동으로 긁어 HA35(50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL) 또는 대조군(PBS)으로 처리했습니다. 간극으로의 세포 이동 및 증식은 살아있는 세포 이미징을 위해 장착된 투과광 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. 상처 봉합은 ImageJ의 상처 치유 크기 플러그인을 사용하여 상처 치유 백분율로 정량화되었습니다. 스크래치 영역과 세포 이동 속도 및 상처 봉합 비율을 24시간에 걸쳐 측정했습니다. 시험 관 내 HA35는 상처 가장자리에서의 세포 증식과 상처 영역으로의 이동의 조합을 통해 소장 장내 단층에서 상처 치유를 가속화합니다. 이러한 방법은 잠재적으로 조산 인간 소장에서 장 재생을 탐구하는 모델로 사용될 수 있습니다.

서론

괴사성 장염(NEC)은 미숙아에서 가장 흔한 위장 응급 상황 중^{하나입니다1.} 이 질병은 장 괴사, 패혈증 및 잠재적으로 사망으로 빠르게 악화 될 수있는 심각한 장 염증을 특징으로합니다. 병인은 불분명하지만 증거에 따르면 NEC는 다인성이며 섭식, 비정상적인 박테리아 집락화 및 미성숙 장 상피 ^2,3의 복잡한 상호 작용의 결과입니다. 미숙아는 장 투과성, 비정상적인 박테리아 집락화 및 낮은 장 세포 재생 능력^4,5를 증가시켜 장 장벽 기능 장애^, 박테리아 전좌 및 NEC 발달의 위험을 증가시킵니다. 따라서 장 상피 성숙을 가속화하고 장 상피의 재생 또는 치유를 촉진하는 전략이나 중재를 식별하는 것이 이 치명적인 질병을 예방하는 데 중요합니다.

연구에 따르면 모유(HM)는 조산아 6,7,8,9,10,11에서 NEC를 예방합니다.

프로토콜

이 연구의 모든 동물 절차는 오클라호마 대학 건강 과학 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 기관 승인 후, 별도의 연구를 위해 안락사 후 조산한 비인간 영장류(NHP, 90% 임신, 올리브 개코원숭이, Papio anubis)의 태아 소장 편의 샘플을 얻었습니다(프로토콜 #101523-16-039-I)²⁰.

1. 조산 비인간 영장류 3D 장내 장내 확립

1. 미디어 준비
   알림: 배지는 표준 무균 기술에 따라 지하실 격리 최대 1주일 전에 준비할 수 있습니다. 원하는 경우 일차 세포에 대한 광범위한 항생제 대신 페니실린/스트렙토마이신(최종 농도 1%)을 사용할 수 있습니다.
   1. 오가노이드 성장 배지 인간 기초 배지 50mL와 오가노이드 보충제 50mL를 혼합하여 인간 오가노이드 성장 배지 + Y-27632(HOGMY)를 준비합니다(재료 표). 200 μL의 광범위한 항생제 (최종 농도 100 μg / mL) (재료 표) 및 Y-27632 (최종 농도 10 μM까지)를 추가하십시오. 벤치 탑에서 실온으로 따뜻하게하십시오.
   2. 오가노이드....

결과

다양한 조직과 기관의 조직 복구 및 상처 치유에 대한 HA의 효과는 잘 문서화되어 있습니다. 그러나 분자량이 35kDa 인 HA가 태아 또는 신생아 소장 치유 및 재생에 미치는 구체적인 효과는 현재 알려져 있지 않습니다. 태아 또는 신생아 소장 모델에서 상처 치유를 촉진하는 HA35의 능력을 테스트하기 위해 NHP 회장 조직에서 3D 장 장내 조직을 생성하고 이 조직을 단일 세포로 추가로 해리하여 2D 장내 유래 단층을 만들었습니다(그림 1A,B). 단층은 컨플루언스로 성장시키고 P200 피펫 팁을 사용하여 수동으로 긁었습니다(그림 1B,C). 그런 다음 단층을 HA35(50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL) 또는 대조군(PBS)으로 처리했습니다. 간극으로의 세포 이동 및 증식은 생세포 이미징(22)을 위해 장착된 투과광 현미경을 사용하여 총

토론

조산아의 위장관은 dysbiosis, 염증성 박테리아 대사 산물 및 독소, 간헐적 저산소증과 관련된 환경 모욕에 반복적으로 노출되어 지속적인 재생 압력을 받고 있습니다^23,24. 불행히도, 미숙아의 장 상피는 기능적 완전성을 빠르게 확립 할 수 없습니다²³, 장벽 기능 장애, 장 투과성 증가, 심한 경우 만연한 장 염증 및 NEC 발달을 초래합니다.

글리코사미노글리칸(GAG)은 모유에 널리 퍼진 다당류의 한 종류로, NEC^15,16의 발달을 방지하는 잠재적인 생리활성 인자입니다. HA는 히알루론산 합성효소에 의해 생성된 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민^25,26

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 mL 혈청학 피펫	피셔 사이언티픽	13-675-49
100x21mm 접시, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	172931
15 mL 원뿔형 튜브	VWR	89039-666
24-웰, TC 처리, 플랫 바텀 플레이트	Corning	3524
37 µ M 가역 세포 여과기	STEMCELL Technologies	27215
50 mL 원뿔형 튜브	VWR	89039-658
70 µ m 멸균 세포 스트레이너	Fisher Scientific	FB22-363-548
알부민, 소(BSA)	VWR	0332-100G
CellTiter-Glo 3D 세포 생존율 분석	Promega	G9681
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
Gentle Cell 해리 시약	STEMCELL Technologies	100-0485
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module	Sartorius	9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010	이것은 HOGMY이지만 Y-27632 또는 항생제가 없습니다. HORM의 기초로도 사용되지만 항생제는 빠져 있습니다.
겔 여과 크로마토그래피로 정제된 Escherichia coli O111:B4의 지질다당	Millipore Sigma	L3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free	Corning	356231
Nunc MicroWell 96-well, Nunclon Delta Treated, Flat-Bottom Microplate	ThermoFisher Scientific	136101
PBS (인산염 완충 식염수), 1X [-] 칼슘, 마그네슘, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	이것은 광범위한 항생제입니다
히알루 론산 나트륨, 연구 등급, HA20K	Lifecore Biomedical	HA20K-1
TC20 자동 세포 계수기	회사 : Bio-Rad	1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0.25 % Trypsin	피셔 사이언티픽	MT25053CI
Y-27632	줄기세포 기술	72302

류