근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 피부의 신속한 효소 해리를 사용하여 높은 수율과 생존력을 가진 인간 일차 세포의 분리 방법, 배양 조건 및 특성화를 설명합니다. 일차 각질세포, 섬유아세포, 슈완 세포는 모두 인간 신생아 포피로부터 수확되며, 이는 표준 관리 절차에 따라 사용할 수 있습니다. 제거 된 피부는 소독되고 피하 지방과 근육은 메스를 사용하여 제거됩니다. 이 방법은 표피 및 진피 층의 효소 및 기계적 분리로 구성되며, 이어서 추가적인 효소 소화가 이뤄져 이들 피부 층 각각으로부터 단일 세포 현탁액을 얻는다. 마지막으로, 단일 세포는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 적절한 세포 배양 배지에서 성장하여 수주에 걸쳐 성장 및 생존력을 유지한다. 함께, 이 간단한 프로토콜은 피부-신경 모델의 시험관내 평가를 위해 단일 피부 조각으로부터 세 가지 세포 유형 모두를 분리, 배양 및 특성화할 수 있게 한다. 추가적으로, 이들 세포는 상처 치유와 관련된 배양물에서 로봇적으로 수행되는 스크래치의 형태로 서로에 대한 그들의 영향 및 시험관내 외상에 대한 그들의 반응을 측정하기 위해 공동 배양물에서 함께 사용될 수 있다.
서론
생체 조직으로부터 유래되고 시험관내 조건 하에서 배양된 1차 세포는 생리학적 상태1과 매우 유사하여, 이들을 생리학적 및 병리생리학적 과정을 조사하기 위한 이상적인 모델이다. 피부는 각질세포, 섬유아세포, 세포세포, 멜라노사이트 및 슈완 세포(SCs)를 포함하는 다수의 세포 유형을 함유하며, 이는 시험관내 실험을 위해 단리되고 배양될 수 있다. 피부의 단일 조각으로부터 각질세포, 섬유아세포 및 SCs를 분리하고 배양하는 방법은 기술되지 않았다. 이 프로토콜의 목표는 두 가지입니다 : 1) 진피 SC의 분리 및 배양을위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 확립하고 2) 단일 인간 포피에서 각질 세포, 섬유 아세포 및 SC를 분리하기위한 효율적이고 강력한 방법을 사용하는 것입니다.
현재, 피부 각질세포 2,3,4 및 섬유아세포 5,6을 분리하기 위한 확립된 프로토콜이 있다. 이 연구는 피부로부터 각질세....
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프로토콜
연구 목적으로 비확인 된 인간 포피 조직의 획득 및 사용은 Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574)에 의해 "인간이 아닌 연구"의 결정을 검토하고 받았다.
참고: 아래의 프로토콜에 따라, 2.4 x 10 6 각질세포, 4.4 x 10 6 섬유아세포 및 1.1 x 106 SCs가 단일 포피로부터 수득된다. 일반적으로, 이들 일차 세포는 실험 조건에 따라 3계대 동안 사용될 수 있다.
1. 1차 세포 및 배양 조건의 분리
- 표피와 진피 분리 절차
- 승인 된 병원 규제 프로토콜에 따라 의사의 치료 절차 표준에 따라 신생아 포피를 습득하십시오. 의사는 출생 후 할례의시기와 제거 된 피부의 양을 결정합니다.
- 적출된 포피를 빙냉 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 기본 배지 8-10 mL가 들어있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 포피를 즉시 세포 배양 실험실로 운반하여 세포를 분리합니다. 1x 항생제/항균제가 들어있는 둘베코의 인산완충식염수(DPBS) 20-25mL로 피부를 두 번 헹구....
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결과
정상 신생아 포피는 원발성 표피 각질세포 및 진피 SC 및 섬유아세포의 단리를 위해 사용되었다. 단리된 일차 세포를 성장 인자를 함유하는 각각의 세포 배양 배지에서 배양하였다. 배양 플라스크에서 SCs 및 섬유아세포를 시딩한 후, 대부분의 세포는 2시간 이내에 플라스크의 바닥에 부착되었다. 각질세포의 경우, 대부분의 각질세포는 24 h에 의해 부착되었다. 분리된 표피 일차 각질세포는 7일째까지 85% 합류에 도달하였고, 특징적인 세포 형태학(조약돌 형상)을 나타내었다(도 1A). SC는 5일째까지 95%의 합류율에 도달하였고 양극성 또는 삼극 형상으로 나타났다(그림 1B). 섬유아세포 배양물은 4일째까지 95% 합류에 도달하였고, 대부분의 세포는 스핀들 형상 형태를 나타내었다(도 1C). 이들 배양물에서 세포형 특이적 단백질 발현을 면역형광염색을 통해 확인하였다. 각질세.......
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토론
이 프로토콜은 포피의 단일 조각, 즉 각질세포, 섬유아세포 및 슈완 세포로부터 세 개의 별개의 세포 집단을 분리하는 방법을 기술한다. 각질세포 및 섬유아세포2,3,5,6을 분리하는데 이용가능한 몇 가지 분리 프로토콜이 있지만, SC 단리를 기술하는 것은 없다. 피부, 각질세포 및 섬유아세포의 주요 구조 세포 외에도 피부는 감각적 구심성 구조와 자율 원심에 의해 고도로 신경질화됩니다. 감각 구심증은 가벼운 접촉, 진동, 통증, 가려움 및 뜨겁고 차가운 감각의 전달에 중요한 역할을합니다. 자율 원심성은 땀샘과 arrector pili 근육을 긴장시킵니다9. 각 신경 축삭은 말초 신경계의 신경교 세포인 SC에 의해 포위된다. SC가 축삭 재생
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공개 사항
다른 모든 저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 Fadia Kamal 박사와 실험실 장비 및 기술 지원을 사용할 수있게 해준 Reyad Elbarbary 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 펜실베니아 주립 대학 허쉬 메디컬 센터의 기관 지원 외에도 NIH (K08 AR060164-01A) 및 DOD (W81XWH-16-1-0725)의 보조금으로 J. C. E.에 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 & 마이크로; M 멸균 필터 (Millex-GP 주사기 필터 장치, 폴리에테르설폰) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µ M 세포 여과기 | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µ M 세포 여과기 | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL 일회용 주사기 | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL 일회용 주사기 (주사기 멸균, 일회용) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL 일회용 주사기 | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | 사용 시 준비 |
| 4% 파라포름알데히드 용액 | ThermoFisher Scientific | J19943. K2 | 사용 준비 완료 및 4°C에서 보관; C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | 사용 시 준비 |
| 70% 에탄올 | Pharmco | 111000200 | |
| 항생제 | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM 기초 매체 | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수는 Ca2+ 및 Mg2+ (DPBS)Corning에서 무료로 제공됩니다 | . 21-031-CV) | ||
| Nunc 15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| 소태아 혈청 (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| 섬유아세포 완전 배지 | ScienCell Research | 2331 | |
| 염소 항-마우스 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 희석 (1:500) |
| 염소 항-토끼 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 희석 (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| 인간 포피 | 연구 목적의 비식별화 인간 포피 조직(Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD 각질세포 배지 (KGM 금 및 보충제) | Lonza | 00192151 및 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin 항체 | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 항체 | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 항체 | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| 다중 챔버 (4 웰 유리 슬라이드) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 항체 | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | 희석 (1:100) |
| Rabbit p75-NTR 항체 | Millipore | AB1554 | 희석 (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | 희석 (1:200) |
| Schwann 세포 배양 배지 | ScienCell Research | 1701 | |
| 정밀 핀셋 DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | 사용 |
| 전 70% 알코올로 살균홍채 가위, 날카롭거나 날카롭습니다. 길이 4– 3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | 사용 전 70% 알코올로 살균 |
| 수술용 날카로운 칼날 (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | 면도날 회사 | 94-0120 | 사용 전 70% 알코올로 살균 |
| T25 배양 플라스크 | Corning | 353109 | |
| Trypsin 중화 완충액(TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| 도립 현미경 | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 모노 – Apotome.2 현미경 | 염색된 세포가 포함된 챔버 슬라이드의 면역형광용 |
| 도립 현미경 | ZEISS | Primovert | 세포 부착 또는 분리를 시각화/관찰하기 위해 |
참고문헌
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J.
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