균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

요약

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

구조 식물학은 식물의 생태, 생리학, 발달 및 진화를 완전히 이해하는 데 없어서는 안될 관점입니다. 진균 종속 영양 식물 (즉, 곰팡이에서 탄소를 얻는 식물)을 연구 할 때 구조적 적응의 놀라운 측면, 곰팡이에 의한 조직 식민지화 패턴 및 지하 기관의 형태 해부학은 발달 전략과 영양소 공급원 인 균사와의 관계를 계몽 할 수 있습니다. 공생 균류의 또 다른 중요한 역할은 난초 씨앗의 발아와 관련이 있습니다. 모든 난초과과 종은 발아 및 묘목 단계(초기 진균이영양)에서 진균종속영양성이며 심지어 성체기에서 광합성을 하는 종도 있습니다. 난초 씨앗에 영양 매장량이 부족하기 때문에 곰팡이 공생체는 기질을 제공하고 발아를 가능하게하는 데 필수적입니다. 구조적 관점에서 발아 단계를 분석하면 곰팡이와 씨앗의 상호 작용에 관한 중요한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기사에서 제안한 것처럼 식물 조직에서 곰팡이 내생식물을 밝히기 위해 다양한 이미징 기술을 적용할 수 있습니다. 식물 장기의 자유형 및 얇은 부분을 염색 한 다음 광학 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있습니다. 밀 배아 응집소에 접합 된 형광 색소를 곰팡이에 적용하고 Calcofluor White와 함께 배양하여 컨포칼 현미경에서 식물 세포벽을 강조 표시 할 수 있습니다. 또한, 주사 및 투과 전자 현미경의 방법론은 mycoheterotrophic 난초에 대해 자세히 설명되어 있으며, 관련 식물에 이러한 프로토콜을 적용 할 가능성을 탐구합니다. 난초 종자의 공생 발아 (즉, 균근 진균이있는 경우)는 빛, 공초점 및 전자 현미경으로 분석하기 위해 발아의 여러 단계에서 얻은 구조를 준비 할 수있는 가능성과 함께 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

서론

식물 형태학 및 해부학을 다루는 식물학의 구조 연구는 전체 유기체를 이해하는 데 기본이며^{1,2, 식물의 생}태, 생리학, 발달 및 진화에 관한 지식을 통합하고 기여하는 데 필수적인 관점을 제공합니다3. 식물 형태학 및 해부학의 방법은 현재 최근에 개발 된 프로토콜, 장비 및 지식뿐만 아니라 100 년 이상 전에 개발 된 것으로 구성됩니다². 보다 최근의 기술(예: 컨포칼 현미경, X선 마이크로단층 촬영)과 함께 고전적인 방법(예: 광학 현미경)의 지속적인 실행 및 적응은 방법론 개발을 가능하게 하는 이론적 지식이라는 동일한 필수 기반을 가지고 있습니다.

식물 해부학 및 형태학의 주요 도구는 이미지입니다. 이러한 분석이 주관적인 해석에 공간을 제공하는 단순한 관찰이라는 오해에도^{불구하고2,}이 영역의 이미지를 분석하고 이해하려면 적용된 방법 (장비, 분석 유형, 방법 론적 절차), 세포 구성 요소, 조직 화학 및 식물체 (조직 조직 및 기능, 개체 발생, 형태 학적 적응). 다양한 방법을 통해 얻은 이미....

프로토콜

1. 샘플 수집, 고정 및 유지 관리

참고 : 완전 MH 식물은 일반적으로 주로 습하고 쓰레기가 풍부한 지역의 어두운 숲 지하층 12,13에서 발견 될 수있는 반면, 부분적으로 MH 식물은 더 개방 된 숲^(12,13)에서 발견 될 수 있습니다. MH 식물은 일반적으로 다양한 모양과 크기의 잘 발달 된 지하 기관을 가지고 있습니다.

1. MH 종을 수집 할 때 지하 장기를 손상시키지 않도록주의하면서 식물 기반 주변의 토양을 탐색하고 지하 기관에서 공중 기관이 분리되지 않도록 땅에서 식물을 끌어 당기지 마십시오.
2. 원예 흙손을 사용하여 공중 구조물 주변을 조심스럽게 파고 뿌리, 줄기, 뿌리 줄기 및 저장 기관과 같은 지하 기관을 탐색하면서 이러한 구조물을 손상시키지 마십시오.
3. 깨지기 쉬운 구조를 보존하기 위해 토양 입자를 제거하고 샘플을 고정하기 전에 수돗물로 이러한 장기를 섬세하게 씻어 나머지 토양 입자를 헹굽니다.
4. 잎 깔짚과 관련된 MH 식물....

결과

식물 조직을 고정하는 필수 단계에 이어 세포 구성 요소 및 조직의 형태, 부피 및 공간 조직을 고려하여 가능한 한 유사한 세포 구조가 살아있는 상태와 유사합니다¹⁶. 화학적 고정 후 샘플에서 이러한 특성을 관찰하십시오(그림 4). 그림 4C-F는 광학 현미경 하에서 적절하게 고정된 샘플을 나타냅니다. 설명된 고정 절차를 따르고 샘플 구조에 익숙해지면 고정 성공을 분석하는 데 도움이 됩니다.

그림 4

토론

식물 해부학 및 형태학의 이미지 분석은^{지하 기관}6,40, 종자의 공생 발아에 대한 구조 분석^39, 공중 및 생식 구조⁴¹에 의해 입증된 바와 같이 목표를 달성하고 진균종속영양 식물과 필수 진균 내생 식물 간의 관계를 이해하는 데 도움이 되는 중요한 잠재력을 가지고 있습니다. . 구조 식물학은 지난 10년 동안 식물 과학의 다른 영역에 대한 명성과 공간을 잃었음에도^{불구하고1,} 개발에 대한 질문에 답하고 발달, 생태학, 생리학 및 진화와 관련된 참신함과 필수 식물 특성을 밝히는 데 여전히 두드러집니다. 이러한 방법은 MH 식물 분석의 중요한 측면을 고려하여 식물의 구조 연구를위한 기초입니다.

MH 식물을 신중하게 수집하기 위해 필수 정보가 제공되며, 그.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세톤	Sigma-Aldrich	179124	(SEM 스텁 장착용)
한천(AA)	시그마-알드리치	A1296	(종자 발아 테스트용)
Calcofluor White	Stain Sigma-Aldrich	18909	형광 염료(셀룰로오스 검출)
구연산염 완충 용액, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(톨루이딘 블루 O 염색용)
전도성 양면 탄소 테이프	Fisher Scientific	50-285-81	(SEM용)
컨포칼 현미경	Zeiss		(모든 모델)
구리 그리드	Sigma-Aldrich	G4776	(TEM용)
임계점 건조기	Balzers		(모든 모델)
저온 유지 장치	Leica Biosystems		(모든 모델)
해부 현미경	Leica Biosystems		(= 실체현미경, 모든 모델)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	현미경 검사용 빠른 장착 매체
에틸 알코올, 순수 (≥ 99.5 %	시그마 - 알드리치	459836	(= 에탄올, 탈수 공정 용)
포름 알데히드 용액, 37 %	시그마 알드리치	252549	(NBF 용액 준비 용)
포르말린 용액, 중성 완충, 10 %	시그마 알드리치	HT501128	조직 조직 고착
젤라틴 캡슐 TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(TEM의 수지 중합 용)
젤라틴 용액, H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(슬라이드 준비용 희석 - OCT 준수)
글루타르알데히드 용액, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(Karnovsky' 용액 준비)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	글리콜 메타크릴레이트(GMA) 임베딩 키트
요오드	시그마-알드리치	207772	(루골 용액 준비용)
질산납(II) 질산	염 시그마-알드리치	228621	Pb(NO3)2(TEM 대비 염색용)
광학 현미경	Olympus		(모든 모델)
LR 백색 아크릴 수지	Sigma-Aldrich	L9774	용 친수성 아크릴 수지
	Sigma-Aldrich	62650	(염색용)
시편 마운트용 금속 스텁	Rave Scientific		(SEM용, 다른 모델)
Microtome	Leica Biosystems		수동 회전식 마이크로톰 또는 기타 모델
오트밀 한천 (OMA)	Millipore	O3506	(종자 발아 테스트 용)
OCT 화합물, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	냉동 조직 용 매립 배지
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4< / sub> (TEM 후위 용)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	밀봉 열가소성 필름
파라포름알데히드	시그마-알드리치	158127	(카르노프스키의 경우) s 용액 준비)
폴리-L-라이신 용액, H2O 0.1%	Sigma-Aldrich	P8920	(슬라이드 준비 - OCT 준수용)
폴리프렙 슬라이드	Sigma-Aldrich	P0425	폴리-L-라이신 코팅 유리 슬라이드
폴리에틸렌 몰딩 컵 트레이	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, GMA 수지에 샘플 삽입용)
폴리에틸렌 몰딩 컵 트레이	Polysciences	17177C-3	(13x19x5mm, GMA 수지에 샘플 삽입용)
요오드화칼	시그마-알드리치	221945	(루골 용액 제제용)
감자 포도당 한천(PDA)	밀리포어	70139	(종자 발아 테스트용)
주사전자현미경	전(		모든 모델)
실란 [(3-아미노프로필)트리에톡시실란]	시그마-알드리치	A3648	(슬라이드 준비용 - 10월 준수용)
실란 준비 슬라이드	시그마-알드리치	S4651	유리 슬라이드
실리카겔 오렌지, 과립	Supelco	10087	(건조 공정용)
소듐 카코딜레이트 트리하이드레이트	시그마-알드리치	C0250	(글루타르알데히드-소듐 카코딜레이트 완충액용)
수산화나트륨	시그마-알드리치	S5881	NaOH(카르노프스키의 경우) 용액 준비 및 TEM 대비 염색)
차아염소산나트륨 용액	시그마-알드리치	425044	NaClO(종자 표면 소독용)
인산나트륨 이염기성, 무수	시그마-알드리치	71640	Na2HPO4(NBF 용액 및 PB 제제용)
인산나트륨 일염기성 일수화물	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4· H2O (NBF 및 PB용)
스퍼터	코터 Balzers		(모든 모델)
수크로스	시그마-알드리치	S0389	C12H22O11 (동결 보호 및 발아 테스트용)
수단 III	시그마-알드리치	S4131	(염색용)
수단 IV	시그마-알드리치	198102	(염색용)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(염색용)
주사기			(3 mL, 모든 브랜드, TEM 대비 염색용)
주사기 필터 유닛, Millex-GV 0.22 µ m	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33mm, 감마 멸균(TEM 대비 염색용)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(모든 모델)
트리페닐테트라졸륨 염화물	: 시그마 - 알드리치	T8877	(종자 발아의 테트라 졸륨 테스트 용)
구연산 삼 나트륨 : 이수화물	시그마 - 알드리치	S1804	Na3< / sub> (C 6 < / sub>H < > 5< / sub > O < > 7< / sub>) · 2H2O (TEM 대비 염색용)
초박절편탐기	Leica Biosystems		(모든 모델)
우라닐 아세테이	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2(TEM 대비 염색용)
진공 펌프			(모든 모델)
밀 배아 응글로티닌, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	형광 염료 접합 렉틴(시알산 및 N-아세틸글루코사미닐 잔류 물 검출)