균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

요약

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

구조 식물학은 식물의 생태, 생리학, 발달 및 진화를 완전히 이해하는 데 없어서는 안될 관점입니다. 진균 종속 영양 식물 (즉, 곰팡이에서 탄소를 얻는 식물)을 연구 할 때 구조적 적응의 놀라운 측면, 곰팡이에 의한 조직 식민지화 패턴 및 지하 기관의 형태 해부학은 발달 전략과 영양소 공급원 인 균사와의 관계를 계몽 할 수 있습니다. 공생 균류의 또 다른 중요한 역할은 난초 씨앗의 발아와 관련이 있습니다. 모든 난초과과 종은 발아 및 묘목 단계(초기 진균이영양)에서 진균종속영양성이며 심지어 성체기에서 광합성을 하는 종도 있습니다. 난초 씨앗에 영양 매장량이 부족하기 때문에 곰팡이 공생체는 기질을 제공하고 발아를 가능하게하는 데 필수적입니다. 구조적 관점에서 발아 단계를 분석하면 곰팡이와 씨앗의 상호 작용에 관한 중요한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기사에서 제안한 것처럼 식물 조직에서 곰팡이 내생식물을 밝히기 위해 다양한 이미징 기술을 적용할 수 있습니다. 식물 장기의 자유형 및 얇은 부분을 염색 한 다음 광학 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있습니다. 밀 배아 응집소에 접합 된 형광 색소를 곰팡이에 적용하고 Calcofluor White와 함께 배양하여 컨포칼 현미경에서 식물 세포벽을 강조 표시 할 수 있습니다. 또한, 주사 및 투과 전자 현미경의 방법론은 mycoheterotrophic 난초에 대해 자세히 설명되어 있으며, 관련 식물에 이러한 프로토콜을 적용 할 가능성을 탐구합니다. 난초 종자의 공생 발아 (즉, 균근 진균이있는 경우)는 빛, 공초점 및 전자 현미경으로 분석하기 위해 발아의 여러 단계에서 얻은 구조를 준비 할 수있는 가능성과 함께 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

서론

식물 형태학 및 해부학을 다루는 식물학의 구조 연구는 전체 유기체를 이해하는 데 기본이며^{1,2, 식물의 생}태, 생리학, 발달 및 진화에 관한 지식을 통합하고 기여하는 데 필수적인 관점을 제공합니다3. 식물 형태학 및 해부학의 방법은 현재 최근에 개발 된 프로토콜, 장비 및 지식뿐만 아니라 100 년 이상 전에 개발 된 것으로 구성됩니다². 보다 최근의 기술(예: 컨포칼 현미경, X선 마이크로단층 촬영)과 함께 고전적인 방법(예: 광학 현미경)의 지속적인 실행 및 적응은 방법론 개발을 가능하게 하는 이론적 지식이라는 동일한 필수 기반을 가지고 있습니다.

식물 해부학 및 형태학의 주요 도구는 이미지입니다. 이러한 분석이 주관적인 해석에 공간을 제공하는 단순한 관찰이라는 오해에도^{불구하고2,}이 영역의 이미지를 분석하고 이해하려면 적용된 방법 (장비, 분석 유형, 방법 론적 절차), 세포 구성 요소, 조직 화학 및 식물체 (조직 조직 및 기능, 개체 발생, 형태 학적 적응). 다양한 방법을 통해 얻은 이미지를 해석하면 형태와 기능을 상호 연관시키고, 구조의 화학적 구성을 해독하고, 분류군을 설명하고, 식물 병원체에 의한 감염을 이해하고, 기타 그러한 평가를 수행 할 수 있습니다.

균사 종속 영양 (MH) 식물 (즉, 균근 균류 ^4,5에서 탄소를 얻는 비 광합성 식물)을 연구 할 때 구조적 적응의 현저한 측면^, 곰팡이에 의한 조직 식민지화 패턴 및 지하 기관의 형태 해부학은 개발 전략과 영양소의 원천 인^균사와의 관계를 계몽 할 수 있습니다. MH 식물의 지하 기관은 일반적으로 토양 곰팡이와의 연관성과 관련된 중요한 적응을 보여 주므로 이러한 해부학 적 및 형태 학적 조사를 수행하는 것이 필수적입니다⁶. MH 종의 공중 기관은 균근 진균이 아니더라도 내생 식물이 이러한 조직에 존재할 수 있으므로 무시해서는 안됩니다 (개인 관찰, 아직 발표되지 않음).

전체 수명주기 동안 MH 종과 균근 진균 결합의 잘 확립 된 필수 성 외에도⁷, 모든 난초 종, 심지어 독립 영양 종조차도 자연 환경에서 초기 의무 진균 종속 영양 단계를 가지고 있습니다. 난초의 배아가 미분화되고 배젖이나 자엽이 없기 때문에 곰팡이 파트너 ^4,8의 영양 지원 없이는 자연 환경에서 발달하고 확립 할 수 없기 때문에 발생합니다. 이를 고려할 때, 공생 발아 프로토콜은 MH 종뿐만 아니라 광합성 난초에도 적용될 수 있으며, 발아 및 프로토 코름 발달에서 난초-곰팡이 특이성을 조사하는 것을 목표로하며, 멸종 위기 종 보존을위한 이니셔티브에 광범위하게 적용되는 방법론 9,10,11.

이 방법 어셈블리에서는 해부학 적 연구 (섹션 1), 표면 분석 및 샘플 선택 (섹션 2), 절편 방법 (자유형 : 섹션 3, 미세 절제술 : 섹션 4, 저온 미세 절제술 : 섹션 5), 염색 및 장착 (섹션 6), 곰팡이 내생 식물의 형광 및 공초점 현미경 (섹션 7), 주사 전자 현미경 (섹션 8), 및 투과 전자 현미경 (섹션 9). 또한 앞서 언급한 이미징 방법을 발아 과정에서 종자, 원생 및 묘목의 곰팡이 집락을 분석하는 데 성공적으로 적용할 수 있기 때문에 난초 종자(MH 및 독립 영양, 섹션 10)에 대한 공생 발아 방법을 설명합니다.

그림 1: 이미징 방법의 개략적 요약. 회로도는 자세히 설명된 프로토콜 단계의 표시를 제공합니다. 약어 : GMA = 글리콜 메타 크릴 레이트, OCT = 최적 절단 온도 화합물, SEM = 주사 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

여기에 자세히 설명된 현미경 기술(그림 1)은 샘플 수집, 고정, 탈수, 매립 및 절편과 같은 필수 단계가 선행됩니다. 선택한 기술에 따라 단계가 다양하기 때문에(그림 1), 준비 및 수집 장소로 운송할 고정제, 고정 전에 샘플을 준비하는 방법, 사용할 탈수 공정(섹션 1), 다양한 매립 가능성 및 절단 방법(섹션 4, 5, 및 9). 그림 1 은 아래에 자세히 설명된 각 현미경 기술에 필요한 모든 단계를 순차적으로 요약한 것입니다.

프로토콜

1. 샘플 수집, 고정 및 유지 관리

참고 : 완전 MH 식물은 일반적으로 주로 습하고 쓰레기가 풍부한 지역의 어두운 숲 지하층 12,13에서 발견 될 수있는 반면, 부분적으로 MH 식물은 더 개방 된 숲^(12,13)에서 발견 될 수 있습니다. MH 식물은 일반적으로 다양한 모양과 크기의 잘 발달 된 지하 기관을 가지고 있습니다.

1. MH 종을 수집 할 때 지하 장기를 손상시키지 않도록주의하면서 식물 기반 주변의 토양을 탐색하고 지하 기관에서 공중 기관이 분리되지 않도록 땅에서 식물을 끌어 당기지 마십시오.
2. 원예 흙손을 사용하여 공중 구조물 주변을 조심스럽게 파고 뿌리, 줄기, 뿌리 줄기 및 저장 기관과 같은 지하 기관을 탐색하면서 이러한 구조물을 손상시키지 마십시오.
3. 깨지기 쉬운 구조를 보존하기 위해 토양 입자를 제거하고 샘플을 고정하기 전에 수돗물로 이러한 장기를 섬세하게 씻어 나머지 토양 입자를 헹굽니다.
4. 잎 깔짚과 관련된 MH 식물은 특별한주의가 필요합니다. 균사를 통해 분해 물질에 연결된 장기를 조심스럽게 수집하고, 연결된 구조에서 이러한 장기를 당기지 말고, 이러한 부분은 매우 섬세하므로 조심스럽게 수집하십시오. 이러한 연결이있는 구조물을 보존하고 분석을 위해 쓰레기도 수집하십시오.
5. 이미징 기술을 사용하여 신선한 물질을 분석하기로 선택한 경우 적절한 수분, 충분한 수분 증발 및 식물 보습으로 밀폐 된 비닐 봉지에 샘플을 보관하여 과도한 물이 샘플과 접촉하지 않도록하십시오. 즉시 실험실로 운반하고 수집 된 당일에 샘플을 분석하면서 분석 할 때 샘플이 여전히 보존되어 있는지주의하십시오.
6. 잘 밀봉 된 용기에 담아 수집 장소로 정착액을 운반하십시오. 광학 현미경 (LM) 및 주사 전자 현미경 (SEM)을 위해 수집 후 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF¹⁴, 표 1) 또는 Karnovsky 용액 (변형¹⁵, 표 2) 중 하나에서 샘플을 신속하게 고정하십시오. Karnovsky의 용액은 0.2 M 인산염 완충액¹⁵로 제조 될 수 있으며, 그 제조법은 표 3에 기재되어있다.
7. 투과 전자 현미경 (TEM)에 의한 분석을 위해, 글루 타르 알데히드 - 나트륨 카코 딜 레이트 완충액 (^{변형 된 16}, 표 4) 안에 4-3 mm 두께의 샘플을 1-2 mm 두께의 더 작은 섹션으로 절편화한다. 드롭 외부에서 잘라낸 모서리는 버립니다. 첨가제 고정제이기 때문에 샘플의 부피보다 10 배 이상 큰 고정제 부피를 갖는 수집 튜브로 섹션을 즉시 옮깁니다 (즉, 분자는 고정 된 단백질¹⁶에 화학적으로 첨가됩니다).
   주의 : 설명 된 세 가지 정착액은 매우 독성이 있습니다. 특히 현장에서 사용하는 동안 흡입을 피하십시오. 장갑을 사용하여 흄 후드에 모든 정착액을 준비하십시오. 비소 가스가 형성 될 수 있으므로 카코 딜 레이트와 산을 혼합하지 마십시오¹⁶.
8. 고정 된 샘플이 정착액에 떠 있으면 식물 조직에 가스가 있음을 나타냅니다. 공기 및 기타 가스는 정착액이 전체 샘플에 침투하는 것을 방지합니다². 모든 샘플이 용액(¹⁷)의 바닥으로 가라앉을 때까지 이들을 더 작은 부분으로 재샘플링하고 진공 펌프(-300 내지 -400 inHg 압력)를 사용하여 조직으로부터 가스를 제거한다. 펌프가 가하는 과도한 압력은 샘플을 손상시킬 수 있으므로 주의하십시오.
9. Karnovsky의 용액 또는 10 % NBF에서 최소 48 시간 후, 샘플을 0.2 M PB (표 3)로 세척하고 일련의 10 %, 30 %, 50 % 및 마지막으로 70 % 에탄올로 탈수시킵니다. 섬세한 샘플의 경우 각 농도에서 30분 동안 탈수합니다. 더 큰 샘플의 경우 1시간 이상 탈수하십시오.
   알림: 70 % 에탄올 용액은 샘플을 저장하기위한 이상적인 매체입니다. 70 % 에탄올의 샘플은 수년간 실온에서 보관할 수 있습니다. 고정제 제거는 고정 후 필수 단계이므로 정착액에 식물 재료를 장기간 보관하지 마십시오².
10. 사후 고정을 진행하기 전에 4°C에서 샘플을 글루타르알데히드-카코딜레이트에 보관하십시오(단계 9.1).

10% 중성 완충 포르말린(NBF)14
단계 1	증류수 80mL에 37-40% 포름알데히드 용액 10mL를 추가합니다.
단계 2	0.4 g의 인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2PO4· H2O) 용액에
단계 3	무수 인산 이염 기산 나트륨 0.65g (Na2HPO4) 추가
단계 4	부피를 100mL로 구성

표 1: 10% 중성 완충 포르말린 레시피 14.

카르노프스키의 해( 수정15)
단계 1	60-70 °C에서 증류수 20mL
단계 2	파라포름알데히드 0.8g을 첨가하여(4% w/v 수득) 교반
단계 3	40 % NaOH 1-4 방울을 넣고 용액이 깨끗해질 때까지 저어줍니다.
단계 4	냉각하고 0.2M 인산염 완충액 pH 7.2 30mL를 추가합니다(표 3).
단계 5	25% 글루타르알데히드를 0.1M PB(pH 7.2)로 희석하여 1% 글루타르알데히드(최종 부피: ~60mL)를 얻습니다.
단계 6	1 % 글루 타르 알데히드 (5 단계)를 4 단계에서 얻은 용액에 첨가하여 최대 100mL의 정착액을 만들 때까지 첨가합니다.

표 2 : Karnovsky의 솔루션 레시피 (수정^{된 15}).

0.2 M 인산염 완충액 (PB) pH 7.2
단계 1	증류수 14.196mL에 무수 인산이염기산나트륨(Na2HPO4) 400g 첨가
단계 2	인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2PO4· H2O)
단계 3	용액이 깨끗해질 때까지 저어줍니다.
단계 4	증류수로 최종 부피를 500mL로 조정
단계 5	pH를 7.2로 조정
단계 6	0.1M PB의 경우 1:1로 희석

표 3: 0.2 M 인산염 완충액 제조법.

3% 글루타르알데히드 0.2 M 나트륨 카코딜레이트 완충액 (개질16)
단계 1	0.2M 카코딜레이트 완충액: 증류수 100mL에 4.28g의 소듐 카코딜레이트 트리하이드레이트 첨가
단계 2	pH를 7.2로 조정
단계 3	2단계의 용액 25mL에 25% 글루타르알데히드 12mL를 추가합니다(0.2M 카코딜레이트 완충액 pH 7.2).
단계 4	증류수로 부피를 100mL로 구성하십시오.

표 4: 3% 글루타르알데히드 0.2 M 나트륨 카코딜레이트 완충액 레시피 (변형된¹⁶).

2. 고정 및 비 고정 재료의 장기 표면 분석

1. 장기, 특히 지하 기관과 잎사귀와 접촉하는 장기의 표면 균사를 분석하려면 분석 된 샘플에 따라 7.5x 이상의 배율로 해부 현미경 (실체 현미경)에서 고정 또는 신선한 물질을 관찰하십시오.
   1. 신선한 재료의 경우 정착액, 70 % 에탄올 (저장된 경우) 또는 수돗물에 담근 샘플을 시각화하십시오. 해부 현미경의 직사광선은 샘플을 건조시키고 손상시킬 수 있으므로 방지하십시오.
   2. 샘플에서 관심 영역을 검색하고, 표면 균사와 rhizomorphs에 의해 안내됩니다. 표면적 근형이 있는 영역을 포함하는 샘플을 선택하여 뿌리와 줄기의 피질 세포 내에서 펠로톤과 균사 코일을 시각화할 수 있습니다.
   3. 선택 후 샘플이 아직 고정되지 않은 경우 1.6 및 1.9 단계를 수행하십시오. 원하는 경우 섹션 3에 설명된 대로 고정 없이 광학 현미경을 사용하여 새로운 샘플을 촬영합니다.
   4. 실체 현미경에 연결된 카메라를 사용하여 장기 표면, 근형체 및 관찰된 기타 구조에서 이미지를 수집합니다. 이러한 경우 재료와 잘 대비되도록 적절한 배경색을 배치하고 가능하면 표면이 덜 거친 배경 재료(예: 용지)를 선택하십시오.

3. 식물 기관의 자유형 섹션

참고: 식물 장기의 자유형 섹션은 특히 작고 얇은 구조의 경우 어려울 수 있습니다. 그러나, 곰팡이 내생 식물이있는 조직의 이러한 부분은 어떤 경우에는 얇은 부분과 비교하여 균사 및 기타 특징을 더 잘 나타낼 수 있습니다.

1. 날카로운 칼날로 신선하거나 고정 된 샘플을 절단하여 가능한 한 얇게 자르고 물 (신선한 경우) 또는 70 % 에탄올 (고정 된 경우)이있는 작은 페트리 접시에 즉시 넣습니다. 작은 붓을 사용하여 섹션을 손상시키지 않고 조작하십시오.
2. 더 까다로운 재료(즉, 작고 얇고 유연한 기관)를 쉽게 절단하려면 샘플을 폴리스티렌 또는 Cecropia 잎자루와 같은 구조로 둘러싸십시오. 샘플을 수용하기 위해 지지대를 조각하고 샘플과 지지물의 얇은 부분을 모두 만듭니다.
3. 섹션 6에 설명된 대로 샘플을 염색하고 장착합니다.

4. 수지에 식물 샘플 매립 및 절편

1. 샘플의 크기와 구성에 따라 70 % 에탄올에 80 %, 96 % 및 2x 100 % 에탄올에 30 분에서 2 시간 동안 더 탈수시킵니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 글리콜 메타크릴레이트(GMA) 수지 키트를 사용하십시오. 추가 고려 사항은 Gerrits and Horobin (1996) ¹⁸ 을 확인하십시오. 그에 따라 침투 및 포함 단계를 따릅니다.
   주의 : GMA 수지는 독성이 있으며 알레르기 반응과 피부, 눈 및 점막 자극을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에 시약을 사용하고 장갑을 사용하십시오.
3. 샘플 크기별로 선택한 매립용 폴리에틸렌 몰딩 트레이를 사용하십시오(예: 큰 샘플의 경우 13mm x 19mm x 5mm, 작은 샘플의 경우 6mm x 8mm x 5mm). 금형 내부에서 원하는 샘플 방향에주의를 기울이고 바늘을 사용하여 방향을 잡으십시오.
4. 중합을 위해, 바람직하게는 실온에서, 완전히 응고 될 때까지 방치하십시오. 경화 과정은 일반적으로 몇 시간이 걸리지 만 다음날 블록을 개봉하는 것이 좋습니다. 중합 후 수지 블록을 금형에서 조심스럽게 분리하고 블록 곡선을 피하기 위해 가능한 한 빨리 블록을 부착하십시오.
5. 부착 될 수지 블록의면을 샌딩하여 평평한 표면을 만듭니다. 수지 블록을 중간 점도의 액체 시아노아크릴레이트 접착제로 나무 직육면체(2cm x 2cm x 3cm 권장)에 붙입니다( 재료 표 참조). 절단이 손상되지 않도록 레진이 완전히 부착되었는지 확인하십시오.
6. 아래 설명된 대로 회전식 마이크로톰에서 절편을 수행합니다.
   주의 : 마이크로톰 나이프의 날은 매우 날카로워 사고를 일으킬 수 있습니다. 모든 안전 조치에 따라 취급하십시오. 나이프에 접근하기 전에(예: 블록 교체, 수지 적시기) 거친 핸드휠을 잠그고 블레이드 안전 덮개를 씌웁니다. 일회용 블레이드는 적절한 장소에 보관하십시오. 블레이드를 교체할 때 매우 주의하십시오.
   참고: 다양한 유형의 나이프(예: 일회용 또는 고정, 유리 또는 강철)를 사용하여 GMA 수지(¹⁸)를 절단할 수 있습니다. 섹션의 품질은 칼이 얼마나 날카로운 지에 달려 있습니다. 칼이 잘 부착되어 움직이지 않는지 확인하십시오. 일회용 칼은 더 나은 절단을 위해 정기적으로 교체해야 할 수도 있습니다.
   1. 나무 직육면체를 블록 홀더에 단단히 부착하십시오. 방향 나사를 사용하여 단면의 방향을 조정하고 나이프 틸트를 사용하여 나이프의 적절한 각도를 확인하십시오. 단면의 두께를 선택합니다. GMA 섹션이 얇을 때 유리 슬라이드에 더 적절하게 부착되므로 트리밍에는 더 두꺼운 설정을 사용하고 선택한 섹션에는 더 얇은 설정을 사용하십시오. 식물 조직의 권장 두께는 5-8 μm입니다.
   2. 시작하기 전에 온도가 높을수록 섹션의 품질이 악화되므로 필요한 경우 실내를 식히십시오. 절편을 위해 증류수가 담긴 비커, 핫 플레이트, 붓 (최소 2 개), 미세 점 핀셋, 파스퇴르 피펫, 유리 슬라이드, 여과지 (또는 티슈 페이퍼) 및 연필 (절편 할 샘플을 식별하기 위해).
   3. 핫 플레이트를 50 ° C로 조정하고 비커를 그 위에 놓습니다. 핫 플레이트의 면적에 따라 가열의 차이에주의하십시오 (일반적으로 중간 영역이 가장자리보다 더 많이 가열되며 중간의 물을 가열하는 것이 바람직합니다).
   4. 유리 슬라이드를 선택하고 연필로 식별하고 슬라이드 표면 전체에 따뜻한 증류수를 피펫팅합니다. 필요한 경우 용액 (예 : 세제 및 물 또는 70 % 에탄올)을 사용하여 물과 유리 사이의 장력을 차단하여 전체 슬라이드가 동일하게 덮 이도록하십시오. 일부 슬라이드 유형은 적절한 섹션 접착력을 얻기 위해 70% 에탄올로 사전 세척해야 합니다.
   5. 수지 블록의 면을 나이프 블레이드 쪽으로 점차적으로 전진시키는 것으로 시작하십시오. 블록을 먼저 전진시키지 않고 절단을 시도하지 마십시오. 그렇지 않으면 장비와 블록이 손상될 수 있습니다. 필요한 경우 더 높은 두께 (10 μm 이상)를 사용하여 블록을 자릅니다.
   6. 적절한 구간에 접근 할 때 핸드 휠로 단호한 일방 통행을하면 단면이 한 번에 만들어집니다. 수지 수분을 확인하십시오. 절단하는 동안 컬링 섹션에 문제가있는 경우 증류수에 담근 붓을 사용하여 절단되는 블록의면을 정기적으로 보습하십시오. 티슈 페이퍼로 과도한 물을 제거하십시오.
   7. 한 쌍의 미세한 포인트 핀셋으로 얻은 부분을 슬라이드 위의 물에 놓습니다. 물과 접촉하면 GMA 수지가 늘어납니다. 필요한 경우 붓을 사용하여 섹션을 부드럽게 펼치고 늘립니다. 다른 붓을 사용하여 칼날에 수지 이물질이 없도록 지속적으로 유지하십시오. 칼날이 젖지 않도록 붓 사이를 전환하지 마십시오.
   8. 슬라이드에서 원하는 모든 섹션을 대기열에 넣은 후 슬라이드의 바닥면을 말리고 핫 플레이트 위에 놓습니다. 여과지(선택 사항)로 부드럽게 두드려 슬라이드 상단에서 과도한 물을 제거합니다. 물이 슬라이드에서 증발 할 때 섹션이 부착됩니다. 과도한 열에 의해 섹션이 손상되는 것을 방지하기 위해 슬라이드를 너무 오래 두지 마십시오.
   9. 슬라이드를 먼지와 태양으로부터 멀리 떨어진 슬라이드 상자에 보관하고 염색 및 기타 절차에 사용하십시오. 슬라이드는 몇 년 동안 보관할 수 있습니다.

5. 식물 샘플 냉동 및 저온 유지 장치로 절편

참고: 생체 조직을 냉동 절단할 때 필수적인 고려 사항은 샘플을 동결할 때 얼음 결정 형성으로 인한 손상을 줄이는 것입니다. 냉동 보호는 일반적으로 글리세롤 또는 자당^19,20과 같은 화학적으로 불활성 인 용액을 주입하여 수행됩니다.

1. 샘플 절편 하루 전에 다음 단계를 수행하십시오.
   1. 100mL의 증류수에 0.2 M PB 100 mL(표 3)를 희석하여 0.1 M PB의 200 mL를 얻었다. 0.1 M PB에서 10 %, 20 % 및 30 % 자당 용액을 준비하십시오 (예 : 10 % 용액의 경우 20 mL의 완충액에 2 g의 자당 추가).
   2. 신선한 샘플의 경우 0.1M PB에서 30분 동안 세척합니다. 정착액의 샘플의 경우 30 분 동안 정착액을 준비하는 데 사용 된 것과 동일한 완충액으로 세척하십시오. 70 % 에탄올 샘플의 경우 50 % 및 30 % 에탄올로 수화하고 각 용액에서 0.1M PB에서 1 시간 동안 세척합니다.
   3. 실온에서 샘플을 10% 슈크로스에서 2시간, 20% 슈크로스에서 2시간, 30% 슈크로스에서 2시간 동안 인큐베이션합니다. 그 후, 4°C에서 30% 슈크로스에서 밤새 배양한다(또는 적어도 3시간 동안; 최대 시간은 48시간).
2. 절편 당일에, 0.1 M PB에서 40 % 및 50 % 슈크로스를 준비하고; 자당 용액을 12 시간 이상 미리 준비하지 마십시오. 4°C에서 각 슈크로스 농도에서 2시간 동안 인큐베이션합니다.
3. 매립을 위해 작은 금형에 OCT 화합물 층(샘플 매립 및 냉동에 사용되는 최적 절단 온도 매체)을 만들고 -20°C에서 유지하여 동결합니다. 주형은 규칙적인 조직학적 주형일 수 있지만, 블록의 성형을 용이하게 하기 위해 종이 또는 은박지는 작은 직육면체를 프레임 및 접착 테이프로 사용하여 만들 수 있다.
4. OCT 화합물의 바닥층이 몰드에서 동결된 후, 저온유지 챔버 내부에서 작업한다(약 -27°C). 50% 슈크로스에서 배양된 샘플을 절편될 방향으로 주형에 놓습니다. 직육면체 블록의 윗면은 일반적으로 단면화의 더 나은 면입니다. 샘플이 놓인 금형에 표시하여 블록을 쉽게 다듬고 올바른 방향을 유지할 수 있습니다.
5. 샘플을 OCT 화합물로 둘러싸고 샘플에 닿는 기포를 터뜨립니다. -20 °C에서 동결하십시오. 블록이 완전히 얼린 상태에서 저온 유지 챔버 (약 -27 ° C) 안에 넣습니다. 사용하기 전에 각각을 풀고 블록 내부의 샘플 위치를 나타내는 표시에주의하십시오.
6. OCT 화합물은 블레이드로 쉽게 절단되므로 블록을 척에 배치하기 전에 적절하게 다듬습니다. 저온 유지 장치 척에 OCT 화합물을 넣고 윗면이 절단되도록 블록을 배치합니다. 영역이 작은 면은 더 나은 단면을 제공합니다. 블록이 척에 잘 부착 될 때까지 기다렸다가 섹션을 시작하기 전에 테스트하십시오.
7. 척을 척 홀더에 단단히 놓습니다. 방향 나사를 사용하여 단면의 방향을 조정합니다. 나이프 틸트를 사용하여 나이프의 각도를 조정합니다. 단면의 두께를 선택합니다. 샘플은 일반적인 수지 섹션보다 두껍게 절편화할 수 있습니다. 5-20 μm 범위의 섹션이 성공적으로 얻어지며 두꺼운 섹션을 만들기가 더 쉽습니다 (컬링이 적고 구조물 손상이 적음).
8. 얼어붙은 블록의 면을 칼날 쪽으로 전진시킵니다. 그렇게 하지 않고 단면화를 시도하지 마십시오. 그렇지 않으면 블록이 척에서 분리되어 손상될 수 있습니다. 필요한 경우 더 높은 두께 (10 μm 이상)를 사용하여 블록을 자릅니다.
9. 적절한 섹션에 접근 할 때 안티 롤 플레이트 (즉, 섹션을 유지하는 투명 플레이트)를 나이프 위에 놓고 핸드 휠로 확고한 단방향 움직임을 만들어 섹션이 한 번에 만들어지도록합니다. 컬링 문제는 안티롤 플레이트를 조정해야 하거나(일반적으로 블레이드를 기준으로 조정 가능) 블레이드에 이물질이 있는 경우 발생할 수 있습니다. 이물질을 제거하기 위해 붓으로 날을 지속적으로 청소하십시오.
10. 실란화 슬라이드(상업용 또는 아세톤²¹에 2% 아미노알킬실란으로 준비) 또는 증류수 21 또는 0.2% 젤라틴에 500μg/mL 폴리-L-라이신으로 준비된 슬라이드(세부 정보²¹ 참조)와 같이 섹션이 쉽게 부착되도록 특수 슬라이드를 사용하십시오. 슬라이드를 실온에서 유지하십시오.
11. 섹션을 슬라이드에 부착하려면 안티롤 플레이트를 들어 올리고 슬라이드가 섹션에 빠르게 닿도록 합니다. 슬라이드가 실온에 있기 때문에 섹션이 즉시 녹아 슬라이드에 부착됩니다. 슬라이드의 처리 된면을 나이프 위 또는 안티 롤 플레이트의 안쪽면에 남아있을 수있는 섹션으로 돌리도록주의하십시오. 단면이 말리는 것을 방지하려면 플레이트를 들어 올리는 즉시 이 단계를 빠르게 수행하고 단면이 뒤틀리지 않도록 주의하십시오.
12. 새 섹션을 추가해야 하는 경우 슬라이드를 저온 유지 챔버 외부(실온)에 두십시오. 원하는 모든 섹션을 슬라이드에 부착 한 후 저온 유지 챔버 내부 또는 냉동실 (-20 ° C 이하)에 보관하십시오. 슬라이드를 습기에 노출시키지 마십시오. 슬라이드 상자에 보관하고 연필로 슬라이드를 식별하는 것을 잊지 마십시오.
    참고: OCT의 슬라이드와 블록은 -20°C에서 보관할 수 있지만 너무 오래 보관하지는 않습니다. 더 나은 결과를 얻으려면 며칠 내에 슬라이드와 블록을 사용하십시오.

6. 광학 현미경을 위한 식물 절편 및 내생 식물 염색

알림: 식물 섹션에는 많은 유형의 얼룩을 사용할 수 있습니다. 내생 균류와 식물 조직을 차별적으로 염색하는 것은 어렵습니다. 염색 절차는 아니지만, 진균 구조를 표시하는 방법은 섹션 7(밀 배아 응집소 접합체를 사용한 형광)에 제시되어 있습니다. 자유형 섹션(섹션 3에서 설명), 수지 섹션(섹션 4) 및 저온 절편(섹션 5)을 염색할 수 있지만 이러한 경우 GMA 수지 및 OCT가 슬라이드에 대한 접착력을 잃기 때문에 이러한 샘플에는 페놀 및 알코올 기반 얼룩이 어렵습니다.

1. 식물 샘플에 대해 다음과 같은 일반적인 염색 방법을 사용하거나 결합하십시오.
   1. 톨루이딘 블루 O^22,23, 식물 절편의 일반적인 염색에 광범위하게 적용되는 방법. 조직의 종 및 유형에 따라 0.1M 인산염 (pH 6.8) 또는 0.09M 시트레이트 완충액 (pH 4.5-4.8)에 0.05 % 톨루이딘 블루 O 용액을 준비하십시오. 슬라이드 염색 용기를 사용하거나 슬라이드가 거의 염색되지 않은 경우 섹션 위에 몇 방울을 떨어 뜨려 GMA 수지 섹션을 2-10 분 동안 배양합니다. 배양 후 증류수 또는 완충액으로 조심스럽게 세척하고 슬라이드를 물로 장착하거나 핫 플레이트에서 건조하여 6.3단계에 설명된 대로 영구 슬라이드를 생성합니다.
   2. 루골 시약² 는 전분의 존재를 나타냅니다. 증류수에 5% 요오드(_I2) 및 10% 요오드화칼륨(KI) 용액을 준비한다. 슬라이드 위에 몇 방울을 추가하여 2분 동안 섹션을 염색한 다음 증류수로 씻습니다. 이 조직 화학적 검사는 일반적으로 임시 슬라이드에 적용됩니다.
   3. 수단 III, IV 및 검정 B^24,25는 상이한 지질에 대해 염색한다. 70 % 에탄올에 0.3 % 수단 (III, IV 또는 흑색 B) 용액을 준비하고 끓을 때까지 따뜻하게하고 식힌다. 상청액을 사용하여 여과하고 밀폐 된 페트리 접시에서 15-30 분 동안 섹션을 배양하십시오. 70 % 에탄올과 증류수로 섹션을 조심스럽게 씻으십시오. 슬라이드를 물로 장착하십시오 (일반적으로 임시 슬라이드에만 적용됨).
      참고: 수단은 알코올 기반 염료이기 때문에 자유형 섹션에 더 적합합니다. GMA 수지 섹션은 일반적으로 슬라이드에서 분리되므로 조심스럽게 염색하십시오.
2. 임시 슬라이드의 경우 섹션을 물이나 글리세린에 장착하고 나중에 관찰하십시오. 커버 슬립을 매니큐어로 밀봉하여 조금 더 오래 보존하십시오.
3. 영구 슬라이드의 경우 합성수지로 섹션을 장착하십시오(예: 급속 장착 매체, 재료 표 참조). 장착 매체를 몇 방울 떨어뜨리고(커버슬립이 넘칠 수 있음) 버블을 피하기 위해 커버슬립을 조심스럽게 넣고 옷못을 사용하여 완전히 마를 때까지 슬라이드를 커버슬립에 대고 누릅니다. 면도날로 건조된 장착 매체를 과도하게 제거합니다.

7. 형광 및 공초점 현미경에서 밀 배아 응집소에 접합된 형광 색소의 적용

알림: 이 방법은 자유형 섹션(섹션 3에서 설명), 수지 섹션(섹션 4) 및 냉동 섹션(섹션 5)에 적용할 수 있습니다. 냉동 절편은 수지 절편과 비교할 때 더 두꺼운 샘플을 제공 할 수 있지만 자유형 단면만큼 두껍지는 않기 때문에 컨 포칼 현미경 용도에 적합 할 수 있습니다. 밀 배아 응집소 (WGA, 재료 표 참조)에 접합 된 형광 크롬은 형광 현미경²⁶에서 진균 이미징에 적용됩니다. 컨포칼 현미경은 식물 구조(²⁷)의 선명한 3차원 이미지를 제공할 수 있지만 필수적인 것은 아니다.

1. 0.1 M PB 28(pH 7.2, 단계 5.1.1 및 표 3 확인)에서 0.2mg/mL WGA-플루오로크롬 접합체의 용액을 준비합니다. 0.1 M PB (pH 7.2)의 1% 칼코플루오르 화이트 용액을 준비한다. 섹션이 직접 배양되므로 소량의 용액을 준비하십시오.
2. 유리 슬라이드의 절편을 WGA-플루오로크롬 접합체 용액²⁹에서 30분 동안 인큐베이션하고, 절편을 덮기에 충분한 부피를 사용하여, 0.1 M PB로 세척한다.
3. 장착 매체로 충분한 부피를 사용하여 calcofluor 용액의 섹션을 배양하십시오. 용액은 관찰 기간 동안 유지 될 수 있습니다.
4. 슬라이드에 커버슬립을 놓고 다음 필터를 사용하여 컨포칼 현미경 또는 형광 광학 현미경으로 관찰합니다: TC/GFP(여기: 470-440, 방출: 525-550, 재료 표의 WGA-플루오로크롬의 경우 - 이 필터²⁹에서 곰팡이 세포벽 형광 녹색) 및 DAPI(여기: 358, 방출: 463, Calcofluor White의 경우)³⁰.
   참고: 3차원 이미지는 컨포칼 현미경(²⁷)에서 Z-시리즈 기능을 사용하여 얻을 수 있습니다.

8. 식물 장기의 주사 전자 현미경

1. 샘플을 고정하고, 탈수를 수행하고, 70% 에탄올에 저장한 후(섹션 1), 한 가지 가능성은 샘플을 절단하여 필요한 경우 SEM 분석을 위해 원하는 표면(예: 내부 조직, 난소 구조)을 노출시키는 것입니다. 날카롭고 새로운 면도날을 사용하고 SEM에서 이러한 영역의 손상을 방지하여 단방향 움직임으로 절단하십시오. 필요한 경우 실체 현미경을 사용하여 샘플을 선택하고 금속 스터브 영역을 고려하여 샘플 크기를 결정합니다.
2. 에탄올 계열의 SEM용 샘플을 추가로 탈수합니다: 절대 에틸 알코올에서 80%, 96% 및 2x(≥99.8%). 작고 섬세한 샘플은 각 농도에서 30분 동안 유지하고 크고 밀도가 높은 샘플은 1시간 동안 유지합니다.
3. 티슈 페이퍼를 사용하여 작은 봉투를 접어 다음 단계를 위해 샘플을 정리하면 큰 샘플은 봉투없이 처리 할 수 있습니다. 편지 나 숫자를 써서 연필로 봉투를 식별하고 각 샘플의 모든 샘플을 기록하십시오. 샘플을 무수 에탄올에 보관하고 오랫동안은 아니지만 가능한 한 빨리 8.4 단계로 진행하십시오.
4. 임계점(CP) 건조를 진행합니다. 표준 작동 절차에 따라 CP 건조기를 작동하십시오. 압력 챔버의 무수 에탄올 (중간 유체)에 샘플을 놓습니다. CO2 임계점(31°C, 7.3 x 106Pa)에서 중간 유체는 전이 유체(액체 이산화탄소) 내로 용해되고, 샘플은 건조된다(³¹).
5. CP 건조 후 가능한 한 빨리 샘플을 건조 용기, 예를 들어 실리카겔이 포함된 밀봉된 플라스크에 보관하십시오. 대기 습도는 재 흡수되면 샘플을 파괴 할 수 있습니다³¹.
6. 금속 스텁을 사용하여 샘플을 장착하십시오. 장착하기 전에 장갑을 끼고 스텁을 조작하고 아세톤에 5분 동안 담가 지방을 제거한 다음 건조시킵니다. 전도성 양면 탄소 접착 테이프를 사용하여 샘플을 스터브에 고정하고 실체 현미경을 사용하여 샘플을 배치하는 데 도움을 주면서 위에서 보는 것이 SEM 이미지에서 가능한 유일한 관점임을 명심하십시오.
7. 핀셋으로 만진 샘플 부품은 일반적으로 손상되므로 미세한 핀셋으로 샘플을 조작하므로 관심 영역(예: 테이프와 접촉하는 영역)에서 멀리 떨어진 부품을 만져 보십시오. 실리카겔로 밀봉 된 페트리 접시에 샘플이있는 스텁을 유지하십시오. 가능한 한 빨리 8.8단계로 진행합니다.
8. 스퍼터 코터를 사용하여 불활성 가스(종종 아르곤(³¹))의 저압 분위기에서 샘플 표면 상에 금속 층, 일반적으로 금 또는 백금을 증착한다. 스퍼터 코터를 사용할 때 표준 작동 절차를 따르십시오. 코팅 두께는 샘플의 지형에 따라 다르며 일반적으로 15-40 nm³² 사이입니다.
9. 코팅된 스터브를 실리카겔로 밀봉된 페트리 접시에 유지하고, 실리카겔이 습도를 유지하는 경우, 샘플은 이러한 방식으로 몇 주 동안 저장될 수 있다. 주사 전자 현미경을 사용하여 샘플을 분석하십시오. 진공 상태의 샘플은 전자 빔에 부딪히고, 그러한 상호 작용으로부터의 신호의 방출은 이미지³¹로서 해석된다. 주사 전자 현미경 작동에 대한 자세한 내용은 Jeffree and Read (1991) ³¹ 및 Bozzola and Russell (1999) ³²를 참조하십시오.
10. 스터브를 재사용하려면 접착 테이프를 당기고 와이어 울로 문지릅니다. 수돗물로 씻고 무수 에탄올에 담그고 적절하게 건조시켜 구성 금속의 산화를 방지합니다.

9. 투과 전자 현미경

1. 1.7단계 및 1.10단계에서 설명한 대로 글루타르알데히드-카코딜레이트 완충액으로 샘플을 접두사로 지정합니다. 12-24시간의 프리픽스 후, 샘플을 0.2M 카코딜레이트 완충액(pH 7.25)에서 10분 동안 3x 세척한다. 0.2M 카코딜레이트 완충액에 1% 사산화오스뮴(_OsO4)을 사용하여 실온에서 어두운 곳에서 12시간 동안 후고정을 수행합니다. 증류수로 3 회 5 분 동안 씻으십시오.
   주의: 카코딜레이트와 사산화오스뮴은 독성이 강하므로 흡입해서는 안 됩니다. 각각의 안전 데이터 시트에 따라 흄 후드에서 사용하십시오.
2. 샘플을 30 %, 50 %, 70 % 및 96 % 에탄올로 각 농도에서 2x 10 분 동안 탈수시킵니다. 그런 다음 매번 3분 동안 절대 알코올로 15회 탈수합니다.
3. 친수성 아크릴 수지 ( 재료 표 참조)에 샘플을 1 : 1 수지 + 무수 에탄올로 한 번, 순수 수지로 각각 8-12 시간 동안 3 회 침투시킵니다. 완전히 응고 될 때까지 60 ° C에서 젤라틴 캡슐에서 중합을 수행합니다 (최대^{17 시간 12} 시간).
4. 수지 블록 내부의 샘플 방향을 면밀히 평가합니다. 면도날로 블록의 상단 부분을 자르고 단면 영역에 샘플을 집중시키는 피라미드 모양을 만듭니다. 다이아몬드 나이프로 울트라마이크로톰에서 반박막 절편(250-500nm)³³ 을 얻고 몇 방울의 물에 유리 슬라이드에 놓습니다.
5. 슬라이드를 60°C의 핫플레이트에 보관합니다. 6.1.1단계에서와 같이 톨루이딘 블루 O로 섹션을 염색하고 얼룩을 완전히 건조시킵니다. 수돗물로 조심스럽게 씻으십시오. 4개의 사분면을 그리고 분석에 가장 적합한 사분면을 선택하여 얻은 단면을 평가합니다.
6. 피라미드 모양이 선택한 사분면을 블록의 윗면에 집중하도록 블록을 자릅니다. 초박형 섹션(50-100 nm)^33,34 생성. 두께는 단면의 간섭 색상에 따라 평가됩니다 : 약 70nm의 단면은 은-금으로 나타나고, 약 100nm는 금색으로 나타나고, 약 200nm의 단면은 청색³⁴로 나타납니다.
7. 구리 그리드를 사용하여 물에서 초박형 섹션을 수집하고 아래에 설명 된대로 우라 닐 아세테이트와 구연산 납을 사용한 대비 염색 방법으로 진행합니다.
   1. 구연산 납 용액 (표 5)을 준비하고 최종 용액을 각각 1mL의 용액과 함께 마이크로 원심 분리 튜브에서 동결시키고 사용 직전에 해동합니다.
   2. 우라닐 아세테이트 용액 준비: 0.625g의 우라닐 아세테이트[_UO2(_CH3COO)₂]를 최근에 끓이고 냉각된 증류수 25mL에 녹입니다. 냉동실의 어두운 플라스크에 보관하십시오.
      주의 : 질산 납은 섭취하면 독성이 있습니다. 1 N NaOH는 부식성이 높습니다. 우라닐 아세테이트는 방사성이며 독성이 있습니다. 섭취, 흡입 또는 피부에 접촉해서는 안됩니다.
   3. 염색 시 준비된 두 시약을 필터 장치(0.22μm 공극, 재료 표 참조)가 있는 별도의 3mL 주사기에 넣습니다. 밀봉 열가소성 필름 (재료 표 참조)과 더 넓은 접시 내부에 CO2₃₂의 트랩으로 가장자리에 NaOH 펠릿을 사용하여 거꾸로 뒤집은 페트리 접시를 준비하십시오 (그림 2 참조).
   4. 첫 번째 방울을 버리고 필름 위에 우라닐 아세테이트 한 방울과 증류수 세 방울을 각 그리드 염색에 놓습니다. 구연산 납과 똑같이하고 증류수 3 방울을 더 넣으십시오.
   5. 그리드 (불투명한면이 아래쪽을 향하게, 섹션이있는 곳)를 우라 닐에서 30 분 (가변 시간) 동안 배양합니다. 증류수 방울에서 3 배를 씻고 매번 광택면의 여과지로 그리드를 부드럽게 건조시킵니다. 구연산 납 방울 (30 분)로 반복하고 씻으십시오.
8. 최소 4시간 후, 투과 전자 현미경으로 그리드를 분석합니다. 이 현미경에서 전자 빔은 진공 상태의 섹션을 통과하고 이미지는 형광 스크린에 투사됩니다. 투과 전자 현미경 작동에 대한 자세한 내용은 Bozzola and Russell (1999) ³²를 참조하십시오.

구연산납 용액 (TEM 조영제 염색용)
단계 1	은박지로 비커 둘러싸기
단계 2	0.266g의 질산 납 [Pb(NO 3) 2] 6mL의 최근 끓여서 냉각 된 증류수에 녹입니다.
단계 3	2 분 동안 교반
단계 4	시트르산 삼 나트륨 [Na3 (C6H5O7) .2H2O] 0.352g을 첨가하십시오 (용액은 유백색을 얻어야 함)
단계 5	15분 동안 교반하고 비커를 은박지로 밀봉한 다음 용액을 10mL 비커로 옮깁니다.
단계 6	1N NaOH 1.6mL와 증류수 2.4mL를 추가합니다(용액은 반투명해야 함).
단계 7	필요한 경우 pH를 12에 가깝게 조정하십시오.

표 5: 구연산납 용액 제조법.

그림 2: 구연산납 및 우라닐 아세테이트 용액과의 대조 염색 계획 . (A) 열가소성 필름으로 거꾸로 뒤집어 (중앙에) 페트리 접시를 준비하여 그 위에 더 넓은 접시 안에 방울을 놓을 수 있습니다. NaOH 펠릿은 중앙 접시 주변의 장소입니다. (B) 우라닐 아세테이트 방울은 문자 U가있는 원에 배치되고 L. DW로 표시된 원의 구연산 납 방울은 증류수 방울을 나타냅니다. 그리드는 컬럼에서 순차적으로 염색되므로 5개의 그리드를 표현된 대로 동시에 염색할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

10. 난초 씨앗의 공생 발아

1. 씨앗의 공생 발아에 사용되는 용액과 모든 재료가 오염을 피하기 위해 멸균되었는지 확인하십시오. 먼저 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 공생 발아 단계는 그림 3에 요약되어 있습니다.
2. 종자 코트의 강성과 두께를 고려하여 과일과 씨앗을 2 % 활성 염소가 포함 된 차아 염소산 나트륨 용액에 10-15 분, 씨앗의 경우 7-10 분 동안 담그면 표면적으로 소독합니다⁹. 얇고 깨지기 쉬운 씨앗은 1:1 희석된 차아염소산나트륨 용액에 담글 수 있습니다. 그 후, 오토클레이브 증류수에서 3x 세척하여 차아염소산염 용액을 제거합니다.
3. 세리 그래픽 직물로 여과하여 씨앗을 회복하고 씨앗을 사용하여 발아 테스트를 진행합니다 (바람직하게). 필요한 경우 실리카겔이 함유 된 유리 플라스크 내부의 여과지 봉투에 4 ° C에서 보관하고 플라스크를 밀폐하고 달라 붙는 필름으로 밀봉하십시오. 마지막 세척에서 감자 포도당 한천 (PDA, 39g / L)으로 물 몇 방울을 옮겨 세척 과정의 효과를 평가합니다.
4. 배양 배지에 종자를 파종하기 전에 아래에 설명된 대로 테트라졸륨 시험(선택 사항)을 통해 생존력을 평가하십시오(³⁵).
   1. 약 10mg의 종자를 증류수에 10% 자당 1mL가 있는 미세 원심분리 튜브에 넣고 실온(약 25°C)에서 24시간 동안 가벼운 곳에서 배양합니다.
   2. 마이크로피펫으로 자당 용액을 제거하고 증류수에 1% 테트라졸륨 용액(트리페닐테트라졸륨 클로라이드) 1mL를 추가합니다. 어둠 속에서 24시간 동안 써모블록에서 40°C에서 배양합니다.
   3. 마이크로 피펫으로 테트라 졸륨 용액을 제거하고 증류수 2x 또는 용액이 제거 될 때까지 씨앗을 씻으십시오. 모든 액체를 제거하십시오. 필요한 경우 씨앗을 분석하기 전에 최대 일주일 동안 (10.3 단계에서와 같이) 냉동실에 보관할 수 있습니다.
   4. 씨앗을 증류수에 다시 현탁시키고 광학 현미경으로 분석하십시오. 생존 가능한 씨앗은 밝은 색에서 진한 붉은 색을 얻는 반면, 생존 할 수없는 씨앗은 자연스러운 색을 유지합니다.
5. 난초 씨앗의 공생 발아를 위해 다음과 같은^{적응 된 9} 프로토콜을 수행하십시오.
   1. 오트밀 한천 (OMA) 배양 배지 (귀리 플레이크 2.5g / L 및 한천 7g / L, pH 6)가있는 페트리 접시에 놓인 오토 클레이브 여과지 디스크 (직경 1-2cm) 위에 씨앗을 배양합니다.
   2. 페트리 접시의 중앙에 발아 절차를 위해 선택한 분리 된 곰팡이의 균사체가 들어있는 배양 배지 조각 (약 1cm²)을 접종합니다. 페트리 접시를 달라 붙는 필름으로 밀봉하고 곰팡이 성장에 더 적합하므로 약 25 ° C 또는 실온의 어둠 속에서 배양하십시오.
   3. 발아 검사의 음성 대조군으로 씨앗과 곰팡이 접종없이 일부 요리를 준비하십시오.
6. 정량적 및 질적 데이터를 수집하고 프로토 코름과 묘목을 촬영하여 매주 발아 결과를 분석합니다. 종자와 원형질의 관찰은 발아를보다 정확하게 평가하기 위해 실체 현미경을 사용하여 수행해야합니다. 아래에서 오는 광원을 사용하면 대비가 더 커서 곰팡이 균사체를 프로토 코럼과 더 쉽게 구별 할 수 있습니다.
   1. 다양한 발달 단계에서 샘플을 수집하고 해부학적 분석을 위해 수정합니다(섹션 1). 발아 중 종자, 원생 생물 및 묘목에서 곰팡이 내생식물을 조사하기 위해 이전에 설명한 모든 이미지 분석을 적용합니다(광학 현미경 - 섹션 4, 5 및 6; 공초점 및 형광 - 섹션 7; SEM 및 TEM - 섹션 8 및 9).
   2. 표 6에 따른 단계 분류에 따른 정량적 결과를 생성합니다. 이 단계는 mycoheterotrophic 난초에서 씨앗의 일반적인 발달을 설명합니다. 매주 데이터를 수집하고 관찰된 각 단계의 초기 날짜가 포함된 표를 수집합니다.
   3. 또한 발아율과 비율을 추정하는 정량적 데이터를 수집합니다. 최소 100개의 시드를 계산하거나 계산 필드를 정의합니다³⁵. 표준화 된 면적의 고정 된 영역으로 구성된 페트리 접시 당 3 개 이상의 계수 필드를 구분하고 매주 평가하십시오. 성장 지수 (GI) 방정식에 따라 수집 된 데이터를 계산하십시오.
      
      여기서 N 0 은 단계₀ 에서 계산 된 종자의 수이고, N 1 은 단계₁ 을 의미하며, 단계 6 (N₆으로 등록 됨) ³⁶까지 이어집니다.

그림 3 : 종자 방법론의 공생 발아의 개략적 요약. 회로도는 프로토콜의 세부 단계에 대한 표시를 제공합니다. 약어 : OMA = 오트밀 한천, PDA = 감자 포도당 한천. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

발아 단계	묘사
0	발아 없음
1	배아의 붓기
2	테스타 파열
3	흡수성 모발이 발달합니다.
4	줄기 투영 개발
5	보호 저울 (포엽) 개발
6	첫 번째 뿌리 개발

표 6 : 발아 테스트의 주기적 분석에 적용되는 프로토 코름 발달 단계에 대한 설명. Otero et ^al.36에 설명 된 단계에서 수정되었습니다.

결과

식물 조직을 고정하는 필수 단계에 이어 세포 구성 요소 및 조직의 형태, 부피 및 공간 조직을 고려하여 가능한 한 유사한 세포 구조가 살아있는 상태와 유사합니다¹⁶. 화학적 고정 후 샘플에서 이러한 특성을 관찰하십시오(그림 4). 그림 4C-F는 광학 현미경 하에서 적절하게 고정된 샘플을 나타냅니다. 설명된 고정 절차를 따르고 샘플 구조에 익숙해지면 고정 성공을 분석하는 데 도움이 됩니다.

그림 4

토론

식물 해부학 및 형태학의 이미지 분석은^{지하 기관}6,40, 종자의 공생 발아에 대한 구조 분석^39, 공중 및 생식 구조⁴¹에 의해 입증된 바와 같이 목표를 달성하고 진균종속영양 식물과 필수 진균 내생 식물 간의 관계를 이해하는 데 도움이 되는 중요한 잠재력을 가지고 있습니다. . 구조 식물학은 지난 10년 동안 식물 과학의 다른 영역에 대한 명성과 공간을 잃었음에도^{불구하고1,} 개발에 대한 질문에 답하고 발달, 생태학, 생리학 및 진화와 관련된 참신함과 필수 식물 특성을 밝히는 데 여전히 두드러집니다. 이러한 방법은 MH 식물 분석의 중요한 측면을 고려하여 식물의 구조 연구를위한 기초입니다.

MH 식물을 신중하게 수집하기 위해 필수 정보가 제공되며, 그...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세톤	Sigma-Aldrich	179124	(SEM 스텁 장착용)
한천(AA)	시그마-알드리치	A1296	(종자 발아 테스트용)
Calcofluor White	Stain Sigma-Aldrich	18909	형광 염료(셀룰로오스 검출)
구연산염 완충 용액, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(톨루이딘 블루 O 염색용)
전도성 양면 탄소 테이프	Fisher Scientific	50-285-81	(SEM용)
컨포칼 현미경	Zeiss		(모든 모델)
구리 그리드	Sigma-Aldrich	G4776	(TEM용)
임계점 건조기	Balzers		(모든 모델)
저온 유지 장치	Leica Biosystems		(모든 모델)
해부 현미경	Leica Biosystems		(= 실체현미경, 모든 모델)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	현미경 검사용 빠른 장착 매체
에틸 알코올, 순수 (≥ 99.5 %	시그마 - 알드리치	459836	(= 에탄올, 탈수 공정 용)
포름 알데히드 용액, 37 %	시그마 알드리치	252549	(NBF 용액 준비 용)
포르말린 용액, 중성 완충, 10 %	시그마 알드리치	HT501128	조직 조직 고착
젤라틴 캡슐 TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(TEM의 수지 중합 용)
젤라틴 용액, H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(슬라이드 준비용 희석 - OCT 준수)
글루타르알데히드 용액, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(Karnovsky' 용액 준비)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	글리콜 메타크릴레이트(GMA) 임베딩 키트
요오드	시그마-알드리치	207772	(루골 용액 준비용)
질산납(II) 질산	염 시그마-알드리치	228621	Pb(NO3)2(TEM 대비 염색용)
광학 현미경	Olympus		(모든 모델)
LR 백색 아크릴 수지	Sigma-Aldrich	L9774	용 친수성 아크릴 수지
	Sigma-Aldrich	62650	(염색용)
시편 마운트용 금속 스텁	Rave Scientific		(SEM용, 다른 모델)
Microtome	Leica Biosystems		수동 회전식 마이크로톰 또는 기타 모델
오트밀 한천 (OMA)	Millipore	O3506	(종자 발아 테스트 용)
OCT 화합물, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	냉동 조직 용 매립 배지
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4< / sub> (TEM 후위 용)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	밀봉 열가소성 필름
파라포름알데히드	시그마-알드리치	158127	(카르노프스키의 경우) s 용액 준비)
폴리-L-라이신 용액, H2O 0.1%	Sigma-Aldrich	P8920	(슬라이드 준비 - OCT 준수용)
폴리프렙 슬라이드	Sigma-Aldrich	P0425	폴리-L-라이신 코팅 유리 슬라이드
폴리에틸렌 몰딩 컵 트레이	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, GMA 수지에 샘플 삽입용)
폴리에틸렌 몰딩 컵 트레이	Polysciences	17177C-3	(13x19x5mm, GMA 수지에 샘플 삽입용)
요오드화칼	시그마-알드리치	221945	(루골 용액 제제용)
감자 포도당 한천(PDA)	밀리포어	70139	(종자 발아 테스트용)
주사전자현미경	전(		모든 모델)
실란 [(3-아미노프로필)트리에톡시실란]	시그마-알드리치	A3648	(슬라이드 준비용 - 10월 준수용)
실란 준비 슬라이드	시그마-알드리치	S4651	유리 슬라이드
실리카겔 오렌지, 과립	Supelco	10087	(건조 공정용)
소듐 카코딜레이트 트리하이드레이트	시그마-알드리치	C0250	(글루타르알데히드-소듐 카코딜레이트 완충액용)
수산화나트륨	시그마-알드리치	S5881	NaOH(카르노프스키의 경우) 용액 준비 및 TEM 대비 염색)
차아염소산나트륨 용액	시그마-알드리치	425044	NaClO(종자 표면 소독용)
인산나트륨 이염기성, 무수	시그마-알드리치	71640	Na2HPO4(NBF 용액 및 PB 제제용)
인산나트륨 일염기성 일수화물	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4· H2O (NBF 및 PB용)
스퍼터	코터 Balzers		(모든 모델)
수크로스	시그마-알드리치	S0389	C12H22O11 (동결 보호 및 발아 테스트용)
수단 III	시그마-알드리치	S4131	(염색용)
수단 IV	시그마-알드리치	198102	(염색용)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(염색용)
주사기			(3 mL, 모든 브랜드, TEM 대비 염색용)
주사기 필터 유닛, Millex-GV 0.22 µ m	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33mm, 감마 멸균(TEM 대비 염색용)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(모든 모델)
트리페닐테트라졸륨 염화물	: 시그마 - 알드리치	T8877	(종자 발아의 테트라 졸륨 테스트 용)
구연산 삼 나트륨 : 이수화물	시그마 - 알드리치	S1804	Na3< / sub> (C 6 < / sub>H < > 5< / sub > O < > 7< / sub>) · 2H2O (TEM 대비 염색용)
초박절편탐기	Leica Biosystems		(모든 모델)
우라닐 아세테이	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2(TEM 대비 염색용)
진공 펌프			(모든 모델)
밀 배아 응글로티닌, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	형광 염료 접합 렉틴(시알산 및 N-아세틸글루코사미닐 잔류 물 검출)