유리체 내 주사는 망막에 바이러스 매개 유전자 요법을 전달하기 위해 양 눈에서 수행되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막에 치료제를 전달하는 방법에는 유리체내(IVT), 망막하, 흉막상, 안구주위 또는 국소 투여를 비롯한 여러 방법이 있습니다. IVT 약물 전달은 눈의 후방을 채우고 눈 구체의 모양을 유지하는 젤라틴 물질인 눈의 유리체액에 주사하는 것을 포함합니다. IVT 경로는 망막 하 전달보다 덜 구체적으로 표적화되지만 훨씬 덜 침습적이며 다양한 안구 질환에 대한 임상 환경에서 널리 사용됩니다.
우리는 이전에 아데노 관련 바이러스(AAV) 매개 유전자 치료 제품(AAV9)의 유리체내 전달의 효능을 입증했습니다. CLN5) 자연적으로 발생하는 CLN5 형태의 신경 세로이드 리포푸신증(NCL)이 있는 양에서. 영향을받은 양은 한쪽 눈에서 IVT 유전자 치료를 받았고 다른 쪽 눈은 내부 대조군으로 사용되었습니다. 망막 구조와 기능은 치료 후 최대 15개월까지 치료된 눈에서 유지된 반면, 치료되지 않은 눈은 사후 검사 중에 점진적으로 기능 저하와 심각한 위축을 보였습니다. 양 연구에 따르면 CLN5 유전자 치료 제품은 2021년 9월 미국 식품의약국(FDA)으로부터 후보 임상시험용 신약(IND)으로 승인되었습니다. 이 논문은 치료 바이러스 벡터를 난소 눈에 IVT 전달하기위한 수술 프로토콜을 자세히 설명합니다.
서론
치료제를 망막에 전달하기 위해 유리체내(IVT), 망막하, 흉막상, 안구주위 또는 국소 투여를 포함하는 여러 방법이 사용될 수 있다. 각 투여 경로는 혈액 망막 장벽 또는 내부 및 외부 제한막과 같은 장벽을 극복하는 것을 포함하며 전달되는 약물 및 특정 망막 표적 1,2에 따라 효능 비율이 다릅니다.
IVT 약물 전달은 눈의 후방을 차지하는 젤라틴 물질 인 눈의 유리체 체액에 주사하는 것을 포함합니다. 유리체 유머의 주요 기능은 눈 구체의 모양을 유지하고 렌즈 및 망막과 같은 안구 조직을 제자리에 유지하는 것입니다. 유리체 체액은 주로 물로 구성되어 있으며 소량의 콜라겐, 히알루 론산 및 기타 비 콜라겐 성 단백질3. IVT 주사는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색 및 여러 유전성 망막 이영양증 4,5를 포함한 광범위한 안구 상태를 치료하기 위해 일상적으로 사용되는 간단하고 일반적인 절차입니다.
뉴....
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프로토콜
모든 실험 프로토콜은 링컨 대학 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 미국 국립 보건원 지침 및 뉴질랜드 동물 복지법 (1999)과 일치합니다. 보더데일 양은 출생14 세에 진단을 받았고 링컨 대학교 연구 농장에서 관리되었습니다. 3개월 된 동형접합체(CLN5-/-) 암양 3마리가 왼쪽 눈에 IVT 단일 주사를 맞았고, 치료되지 않은 오른쪽 눈은 내부 대조군 역할을 했습니다. 전기 망막 조영술 및 병리학 데이터는 과거의 건강 및 영향을받은 대조군 데이터와 비교되었습니다. 이 연구에 사용된 바이러스 벡터는 치킨 베타 작용(CBh) 프로모터와 코돈 최적화된 양 CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt)를 포함하는 자가 상보적인 아데노 관련 바이러스 혈청형 9였습니다. 바이러스 벡터는 미국 노스캐롤라이나주 노스캐롤라이나 대학교 벡터 코어에 의해 제공되었다.
1. 수술 전
- 수술 키트를 오토클레이브합니다(그림 1).
- 수술 전에 양을 24 시간 동안 금식하십시오.
- 수술 전에 생체중을 기록하십시오.
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결과
CLN5 NCL을 가진 양에서 망막 기능 장애 및 퇴행을 약화시키는 CLN5 유전자 요법 벡터의 IVT 전달의 효능은 이전에 이 연구 그룹15에 의해 입증되었습니다. 영향을 받은 양은 AAV 혈청형 9(AAV9) 벡터(AAV9)에 패키징된 CLN5의 단일 100μL IVT 주사를 받았습니다. CLN5)를 한쪽 눈으로, 반대쪽 눈은 치료되지 않은 내부 대조군 역할을합니다. 시력은 주사 시점의 연령 (3 개월)부터 말기 질환 (18 개월)까지 매월 평가되었다. 망막 조직학의 사후 분석은 치료된 눈과 치료되지 않은 눈뿐만 아니라 연령이 일치하는 건강한 대조군과 CLN5에 영향을 받은 대조군에서 수행되었습니다.
망막 조영술(ERG) 분석은 치료된 눈에서 보존된 망막 기능을 입증한 반면, 치료되지 않은 눈은 CLN5에 영향을 받은 동물과 유사한 방식으로 감소했습니다(그림 4)
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토론
유리체 내 주사는 인간 안과에서 가장 일반적인 수술 절차 중 하나이며 양의 망막에 AAV 매개 유전자 요법을 전달하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 우리는 이전에 AAV9의 효능을 입증했습니다. CLN5 유전자 요법은 CLN5 NCL15로 양에서 망막 기능 장애 및 퇴행을 약화시키는 유리체 내 전달을 받았습니다. 인간 NCL 환자에게이 투여 경로의 번역이 또한 유익한 것으로 입증 될 것으로 기대된다.
양의 눈에 소량 IVT 주사를 위한 프로토콜은 비교적 간단하고 비침습적이며 쉽게 재현할 수 있고 비전문가도 쉽게 배울 수 있습니다. 성공 여부는 망막 내의 표적 세포, 전달되는 치료법, 주사 자체의 위치와 방향에 달려 있습니다. IVT 주사는 종종 망막 내층을 표적으로 하는 데 가장 효과적인 것으로 생각되지만, 많은 연구자들은 망막 외막이 질병 발병기전의 주요 위치인 질병에서 IVT 주사의 효능을 입증했습니다
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 Steve Heap 박사 (BVSc, CertVOphthal)가이 프로토콜을 수립하고 Murray et al.15에 의해 설명 된 주사를 수행하는 데 도움을 준 것에 대해 인정하고자합니다. 저자는 또한 CureKids New Zealand, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc 및 Batten Disease Support and Research Association의 자금 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 영구적으로 부착된 0.5인치 바늘이 있는 1mL 저데드 스페이스 안전 주사기 | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin 안전 주사기 또는 유사한 |
| 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave 튜브를 사용하여 사용 전 살균 |
| 마취기와 가스 벤치 및 모니터 | Hyvet Anesthesia, 크라이스트처치, 뉴질랜드 | ||
| 항생제 안약 | Teva Pharma Ltd, 오클랜드, 뉴질랜드 | 상업명: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam 진정제 | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, 뉴질랜드 | 5mg/mL | |
| 기관내관 | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, 영국 | 표준, 수갑. 양 크기에 따라 사이즈 7, 7.5 또는 8 | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | 또는 유사한 |
| 필터 팁 | Interlab, 오클랜드, 뉴질랜드 | 10, 200 및 1,000 &마이크로; 엘 | |
| 포름알데히드 용액 (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | 0.9% NaCl |
| 염소 항토끼 Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | :500 |
| Isoflurane 마취제 | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl 마취제/진통제 | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| 후두경 (수의학) | KaWe Medical, Denmark | Miller C 블레이드, 크기 2 | |
| 바늘 | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, 또는 이와 유사한 |
| 비스테로이드성 항염증제 | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | 상업명: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | 또는 이와 유사한 |
| 비이빨 헤모스탯 | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | 또는 이와 유사한 |
| 일반 염소 혈청 | Thermo Fisher Scientific, 크라이스트처치, 뉴질랜드 | 16210072 | |
| 산소 (의료) | BOC 가스, 크라이스트처치, 뉴질랜드 | D2 실린더, 가스 코드 180 | |
| 인산염 완충 식염수 | Thermo Fisher Scientific, 크라이스트처치, 뉴질랜드 | 10010023 | 멸균, 여과된 |
| 포비돈-요오드 용액 | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | 상업명: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | 1:2,500 |
| 의 희석액에서 사용치킨 베타 작용(CBh) 프로모터 및 코돈 최적화 양 CLN5를 포함하는 자가 보완성 아데노 관련 바이러스 혈청형 9 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| 염화나트륨 0.9% IV 용액 | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | 상업명: 식염수 용액 |
| 피하 항생제 | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, 웰링턴, 뉴질랜드 | 상업 이름: Duplocillin LA (150,000 IU/mL 프로카인 페니실린 및 115,000 IU/mL 벤자틴 페니실린) | |
| 외과용 날카로운 뭉툭한 곡선 가위 | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | 멸균 주사기; 유도 약물 작성용 10mL, 식염수 |
| Virkon 소독제 분말 | EBOS Group Ltd, 뉴질랜드 크라이스트처치 | 28461115 |
참고문헌
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research.
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