이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.
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이 논문에서
요약
초록
복잡한 세포 환경은 단일 분자 운동성 분석에 어려움을 야기합니다. 그러나 이미징 기술의 발전으로 단일 분자 연구가 개선되었으며 형광 태그 분자의 동적 거동을 감지하고 이해하는 데 엄청난 인기를 얻었습니다. 여기에서는 TIRF(전반사 형광) 현미경을 사용하여 kinesin-3 계열 모터의 체외 단일 분자 연구에 대한 자세한 방법을 설명합니다. Kinesin-3는 세포 내 화물 수송에서 세포 분열, 발달에 이르기까지 세포 및 생리적 기능에 중요한 역할을 하는 대가족입니다. 우리는 이전에 구성 활성 이량 체 키네신 -3 모터가 포유류 세포에서 모터를 발현하여 제조 된 세포 용해물을 사용하여 단일 분자 수준에서 높은 미세 소관 친화력으로 빠르고 초 프로세스 운동성을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 우리 실험실은 세포, 생화학 및 생물 물리학 적 접근법을 사용하여 kinesin-3 모터와 조절 메커니즘을 연구하며, 이러한 연구는 대규모로 정제 된 단백질을 요구합니다. 포유류 세포를 사용하여 이러한 모터의 발현 및 정제는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 반면, 원핵생물 발현 시스템에서의 발현은 상당히 응집되고 비활성 단백질을 초래했습니다. 박테리아 정제 시스템과 포유류 세포 용해물의 한계를 극복하기 위해 당사는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 구축했습니다. kinesin-3 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 감소시키는 3-탠덤 형광 단백질(3xmCitirine 또는 3xmCit)로 C-말단 태그가 지정되어 있습니다. Sf9 정제 단백질의 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 글라이딩 분석은 키네신-3 모터가 포유류 세포 용해물을 사용한 이전 연구와 유사하게 빠르고 초공정적임을 보여줍니다. 이러한 분석을 사용하는 다른 응용 분야에는 모터의 올리고머 조건, 생화학 연구를 병행하는 특정 결합 파트너 및 운동 상태에 대한 자세한 지식이 포함됩니다.
서론
엄청나게 붐비는 세포 환경은 예정된 단백질과 분자를 분류하는 데 많은 문제를 제기합니다. 세포질 내 분자의 조직과 시공간 분포의 이러한 강렬한 작업량은 분자 모터와 세포 골격 트랙에 의해 촉진됩니다. 분자 모터는 ATP와 같은 에너지 통화를 가수분해하고 운동 및 힘 생성중에 해당 에너지를 활용하는 효소입니다1. 아미노산 서열 유사성에 따라 키네신은 14 개의 패밀리로 그룹화되며 이러한 유사성에도 불구하고 각 모터는 세포의 기능에 고유하게 기여합니다. Kinesin-3 제품군 모터는 소포 수송, 신호 전달, 유사분열, 핵 이동 및 발달 3,4,5를 포함한 다양한 세포 및 생리적 기능과 관련된 5개의 하위 패밀리(KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 및 KIF28)2로 구성된 가장 큰 모터 중 하나입니다. 키네신-3 수송 기능의 손상은 많은 신경퇴행성 장애, 발달 결함 및암 질환과 관련이 있습니다6,7,8,9.<....
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프로토콜
1. Sf9 배양, 형질감염 및 바이러스 생성
참고: 9°C에서 항생제/항진균제 없이 100mL 멸균 일회용 원추형 플라스크에 Sf-900/SFM 배지 30mL에 Sf28 세포를 유지합니다. 현탁액 배양물을 오비탈 쉐이커에서 90 rpm으로 유지한다. CO2 공급 및 습도 유지가 필요하지 않습니다. 세포는 일반적으로 4일째에 2.0 x 106 cells/mL 밀도에 도달하기 위해 0.5 x 106 cells/mL를 접종하여 4일마다 계대 배양됩니다.
- P0 바이러스 스톡 생성
- 형질감염을 위해, 시드 세포를 4.5 x 105 cells/mL 컨플루언시를 갖는 35 mm 접시에 넣고 흔들지 않고 28°C에서 유지한다.
- 24시간 후, 일단 세포가 부착되고 건강해 보이면 아래에 설명된 대로 형질감염을 진행합니다.
- 튜브 A: 구성 활성 KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG 특이적 키네신-3 모터에 대해 코딩하는 1μg의 bacmid DNA를 보충되지 않은 Grace's 배지 100μL와 혼합합니다. ....
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결과
Sf9-바쿨로바이러스 발현을 사용하여 활성 및 기능성 재조합 모터 단백질을 대규모로 발현하고 정제하려면 시스템이 Sf9 세포를 감염시키기 위해 코딩 서열을 안정적으로 운반하는 바이러스 입자를 생성해야 합니다. 이를 달성하기 위해, Sf9 세포를 KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG를 코딩하는 재조합 바크미드로 형질감염시켰다. 72시간 후, 상당한 세포 집단이 확대된 세포와 핵(그림 1 및 그림 2)과 함께 녹색 형광 단백질(mCitrine)의 발현을 보였으며, 이는 바이러스 입자(P0)의 성공적인 생성을 시사합니다. 이러한 바이러스 입자는 저장 및 대규모 감염을 위한 P1 바이러스 스톡을 생성하기 위해 더 많은 부피로 신선한 Sf9 개체군을 감염시킴으로써 더욱 확장되었습니다. 키네신-3 모터의 정제를 위해, Sf9 세포의 30mL 배양물을 1mL의 P1 바이러스 입자로 감염시켰다. 감염 72시간 후, 녹색 형광 .......
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토론
Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템은 고처리량 단백질 생산을 위한 가장 다재다능하고 성공적인 방법 중 하나입니다 19,36,37. Sf9 세포의 번역후 변형 능력은 포유동물 시스템(15)과 매우 유사하다. 이 시스템을 사용할 때의 상당한 단점은 느리고 오염에 민감하다는 것입니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 Sf9 세포에서 효율적인 감염과 성공적인 발현이며, 이는 오염 없이 Sf9 세포의 적절한 취급 및 유지가 필요합니다. 이 시스템에는 먼지가 없는 전용 공간과 온도 제어 인큐베이터 및 셰이커와 같은 기기가 필요합니다. 불규칙한 세포 배양 관행과 자란 배양의 사용은 감염 불량, 느린 성장 및 심각한 세포 사멸을 초래할 것입니다.
Sf9 세포에서 발현되는 단백질의 FLAG 태.......
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공개 사항
저자는 선언 할 경쟁 재정적 이익이 없습니다.
감사의 글
V.S.와 P.S. Kristen J. Verhey 교수 (미시간 대학교, 앤아버, 미시건, 미국)와 Roop Mallik 교수 (인도 뭄바이의 인도 봄베이 공과 대학 (IITB))에게 연구 전반에 걸친 무조건적인 지원에 감사드립니다. 추신 : 프로젝트 전반에 걸쳐 그녀의 지원에 대해 Sivapriya Kirubakaran 박사에게 감사드립니다. VS는 DBT(보조금 번호: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 및 BT/RLF/재진입/45/2015) 및 DST-SERB(보조금 번호: ECR/2016/000913)를 통한 자금 지원을 인정합니다. PKN은 자금 조달을 위해 ICMR을 인정합니다 (보조금 번호 5 / 13 / 13 / 2019 / NCD-III). 추신 : DST (보조금 번호 : SR / WOS-A / LS-73 / 2017)의 자금 지원을 인정합니다. DJS는 IIT Gandhinagar의 친목을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sf9 배양 및 형질주입 재료 | |||
| anti-FLAG M2 친화성 | Biolegend | 651502 | 단백질 정제용 |
| 아프로티닌 | 시그마 | A6279 | 단백질 정제용 |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | Sf9 형질주입 |
| DTT | Sigma | D5545 | 운동성 분석 및 단백질 정제 |
| FLAG 펩타이드 | Sigma | F3290 | 단백질 정제 용 |
| 글리세롤 | Sigma | G5516 | 단백질 동결 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Sf9 용해 완충액 |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | 용 Sf9 용해 완충액 |
| KCl | Sigma | P9541 | 완충액 준비 용 |
| 단백질 정제용 | Leupeptin | Sigma | L2884 |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | 완충액 준비용 |
| NaCl | Sigma | S7653 | 용해 완충액 |
| PMSF | Sigma | P7626 | 단백질 정제용 |
| Sf9 세포 | Pucadyil 박사(Indian Institute of Science)의 친절한 선물 Education and Research, 인도 푸네). | 바큘로비르 발현 및 단백질 정제용 | |
| Sf9 배양 병 | Thermo Scientific | 4115-0125 | 현탁 배양용 |
| Sf-900/SFM 배지 (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | Sf9 세포 배양용 |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Sf9 세포용 용해 완충액 준비 |
| Unsupplemented Grace' s 매체 | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | Sf9 트랜스펙션 |
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| ATP | Sigma | A2647 | 운동성 및 글라이딩 분석용 |
| BSA | Sigma | A2153 | 차단형 운동성 챔버용 |
| Catalase | Sigma | C9322 | 용 운동성 및 글라이딩 분석 |
| DMSO | Sigma | D5879 | 로다민 |
| EGTA | Sigma | 3777 | 완충액 준비용 |
| Glucose | Sigma | G7021 | 운동성 및 글라이딩 분석용 |
| 포도당 산화효소 | Sigma | G2133 | 운동성 및 글라이딩 분석용 |
| GTP | Sigma | G8877 | 미세소관 중합용 |
| KOH | Sigma | P1767 | 준비 PIPES 버퍼 pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | 준비용 운동성 및 글라이딩 분석 버퍼 |
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| 현미경 및 기타 기기 | |||
| 0.5ml, 1.5 및 2ml 마이크로 원심분리 튜브 | 준비용Eppendorf | Sf9 배양 및 정제용 | |
| 10ml 일회용 멸균 피펫 | Eppendorf | Sf9 배양 및 정제용 | |
| 10ul, 200ul, 1ml 마이크로피펫 팁 | Eppendorf | Sf9 배양 및 정제 | |
| 15ml concal 튜브 | Eppendorf | Sf9 배양 및 정제용 | |
| 35mm 세포 배양 접시 | Cole Palmer | 15179-39 | Sf9 배양 |
| 균형 | Sartorious | 0.01g-300g | |
| 벤치 탑 구공 진탕 인큐베이터 | REMI | 28oC | |
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| 유리 슬라이드 | 블루 스타 | 운동성 챔버 제작용 | |
| 가열 블록 | Neuation | 용해 파라핀 왁스 | |
| 도립 현미경 | Nikon Eclipse Ti- U | 단백질 발현 확인 | |
| 레이저 | 488nm (100mW) | TIRF 이미징 | |
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| ThermoMixer | Eppendorf | 미세소관 중합용 | |
| 초원심분리기 로터 | Beckman coulter | SW60Ti 로터 | |
| 초원심분리기 튜브 | Beckman | 5 mL, 개방형 Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | 시료 mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | 운동 챔버를 밀봉하기 위해 |
참고문헌
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
- Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
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재인쇄 및 허가
