이 프로토콜은 생체외 전기생리학적 자극을 위한 래트 전체 좌골 신경 조직의 제조를 기술하고, 환경적으로 조절된, 두 구획, 관류 식염수 욕조에서 기록한다.
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이 논문에서
요약
초록
생체외 제제는 국소 조직 구조를 보존하면서 신체의 나머지 부분으로부터 격리된 많은 신경생리학적 과정의 연구를 가능하게 한다. 이 연구는 버퍼 준비, 동물 절차, 장비 설정 및 신경 생리 학적 기록을 포함하여 생체 외 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 준비를 설명합니다. 이 작업은이 방법으로 가능한 다양한 유형의 실험에 대한 개요를 제공합니다. 개요 된 방법은 결과의 최적 일관성을 위해 엄격하게 통제 된 조건에서 추출 된 말초 신경 조직에 6 시간의 자극 및 기록을 제공하는 것을 목표로합니다. 이 방법을 사용하여 얻은 결과는 실험의 전체 기간 동안 밀리볼트 범위의 피크 대 피크 진폭을 갖는 A-파이버 화합물 작용 전위(CAP)입니다. CAP 진폭과 모양은 일관되고 신뢰할 수 있으므로 새로운 전극을 기존 모델 또는 화학 물질의 사용, 외과 적 변경 또는 신경 조절 자극 기술의 사용과 같은 조직에 대한 개입의 영향을 테스트하고 비교하는 데 유용합니다. 백금-이리듐 접촉부를 갖는 기존의 상업적으로 이용가능한 커프 전극과 맞춤형 전도성 엘라스토머 전극 둘 다를 시험하였고, 신경 자극 강도-지속시간 반응의 관점에서 유사한 결과를 제공하였다.
서론
실리코에서 모델링된 바와 같은 근본적인 신경 기능에 대한 현재의 이해는 여러 측면에서, 특히 소마, 축삭돌기 및 덴드라이트의 외부 신경 조직 구획화의 효과와 관련하여 결여되어 있다. 축삭-미엘린 상호작용은 종래의 전기 자극 반응을 적절히 포착하는 MRG1(포유동물 신경에 대한)과 같은 상세한 계산 신경 모델조차도, 고주파 블록 이월오버2 또는 2차 발병 반응3과 같은 다른 실험적으로 관찰된 거동을 포착하지 못한다는 사실에 의해 입증된 바와 같이 여전히 잘 이해되지 않는다.
이 프로토콜은 표준화된 준비 프로토콜을 사용하여 신경을 분리하고, 그 환경을 제어하고, 생체내 맥락에서 생체외 맥락으로 이를 제거하기 위해 표준화된 준비 프로토콜을 사용하여 급성 소형 실험실 동물 모델에서 신경 수준에서 신경 생리학적 과정을 효율적으로 조사하는 방법을 제공한다. 이것은 신경 거동을 변경하고 측정 결과 또는 그들의 해석 4,5을 혼란스럽게하기 위해 생체 내 신경 자극 프로토콜에 의해 사용되는 다른 신체 과정 ....
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프로토콜
모든 동물 관리 및 절차는 동물 (과학 절차) 법 (1986)에 따라 영국 내무부에서 발행 한 적절한 라이센스에 따라 수행되었으며 임페리얼 칼리지 런던의 동물 복지 및 윤리 검토위원회의 승인을 받았습니다.
1. 완충액의 제조
참고: 프로토콜의 이 부분은 1x 농도에서 수정된 Krebs-Henseleit Buffer (mKHB)의 제조와 관련된 최종 단계를 제외하고는 나머지 프로토콜에 앞서 잘 수행될 수 있습니다.
- 1 MCaCl2 원액 준비
- 깨끗한 100 mL 비이커에CaCl2 이수화물 14.701 g을 첨가하십시오. ~ 75 mL의 탈이온수를 첨가하고 소금이 완전히 용해 될 때까지 저어줍니다.
- 용액을 100 mL 점진적 플라스크로 옮기고 100 mL 부피에 도달할 때까지 탈이온수를 첨가한다. 용액을 병에 옮기고 4 °C의 냉장고에 보관하십시오.
- 10x 농축 mKHB 재고 준비
- 66.03 g의 염화나트륨(NaCl), 3.57 g의 염화칼륨(KCl), 1.63 g의 인산이수소칼륨(KH2PO4) 및 1.4....
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결과
이 프로토콜로 얻을 수 있는 대표적인 결과는 좌골 신경 내의 A형 신경 섬유로부터의 일관된 복합 작용 전위이다. 이러한 작용 전위는 일반적으로 전극에서 약 1mV의 피크 대 피크 진폭을 가지며 따라서 증폭되면 100mV입니다(그림 2). 유사한 자극 진폭과 펄스 폭은 유사한 CAP 진폭을 산출해야 한다. 전도성 엘라스토머 커프 전극은 일반적으로 상업적으로 이용가능한 백금 커프 전극에 비해 동일한 CAP 진폭을 얻기 위해 약간 더 높은 자극 진폭을 필요로 할 것이다. 이러한 차이는 일반적으로 다른 동물로부터 오는 신경을 자극하는 데 필요한 자극 진폭의 변화와 비교하여 작다. 이는 신경 크기와 커프 핏의 작은 차이가 커프 재료에 관계없이 특정 CAP 진폭을 얻기 위해 필요한 자극 진폭에 큰 영향을 미치기 때문입니다. 이는 상이한 완충액 조성물, 예컨대 상이한 이온 농도 또는 테트로도톡신과 같은 신경 흥분성 또는 억제 물질의 첨가와 같은 효과를 시험하는데 사용될 수 있다. 완충 폐.......
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토론
이 연구에서, 우리는 생체외 신경 생리학을 위해 쥐 좌골 신경을 준비하기위한 프로토콜을 기술했다. 조직 추출은 동물 취급, 마취, 도태 및 해부를 포함하여 약 30 분이 소요되며, 신경 청소, 욕조 배치 및 전극 이식은 녹음을 시작하기 전에 추가 30 분이 필요합니다. 완충액 준비는 30 분 안에 수행 할 수 있지만 나머지 실험보다 앞서 수행 할 수 있습니다. 이러한 유형의 준비 및 실험은 과거 7,12에서 동일한 조직 유형에 대해 유사한 완충액을 사용하여 사용 및 기술되었습니다. 그러나 저자의 지식에 따르면, 버퍼 준비, 해부, 장비 설정 및 후속 기록에 대한 설명이 동일한 문서에 제공된 것은 이번이 처음입니다.
이 프로토콜은 시험관 내 또는 생체내 맥락에서 가능하지 않을 신경생리학에서 매우 다양한 실험을 가능하게 할 수 있다.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
오픈 액세스 문:
오픈 액세스를 위해 저자는 크리에이티브 공통 저작자 표시 (CC BY) 라이센스 (UKRI가 허용하는 경우, '공개 정부 라이센스'또는 '크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 번호 파생 상품 (CC BY-ND) 라이센스가 대신 명시 될 수 있음)를 저자 수락 원고 버전에 적용했습니다.
데이터 공유:
이 기사의 그림에 사용 된 원시 데이터는 저자가 과도한 예약없이 사용할 수 있습니다.
감사의 글
저자들은 GlaxoSmithKline Pharmaceuticals의 Gerald Hunsberger 박사, King of Prussia, PA, USA, Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK)가 원래의 신경 준비 기술을 우리와 공유했음을 인정합니다. 저자들은 Robert Toth가 Dual-Chamber 신경 목욕 디자인을 인정했습니다. 저자들은 EPSRC (Engineering and Physical Sciences Research Council)의 HTCA(Healthcare Technologies Challenge Awards) 보조금의 자금을 인정합니다. 저자들은 Adrien Rapeaux (EP / L016796 / 1)에 자금을 지원하기 위해 Imperial College London의 고성능 임베디드 및 분산 시스템 센터 (HiPEDS CDT)를 인정합니다. Adrien Rapeaux는 현재 영국 치매 연구소, 케어 연구 및 기술 센터에서 자금을 지원하고 있습니다. 저자들은 JoVE 비디오 기사를 제작하는 동안 실험과 동물 조직에 대한 접근에 대한 도움을 얻기 위해 생명 공학과에있는 임페리얼 칼리지의 잭 베일리 (Zack Bailey)를 감사하게 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 L 유리병 | VWR International Ltd | 215-1595 | 붕규산 유리 |
| 1 L 유리 졸업 플라스크 | VWR International Ltd | 612-3626 | 붕규산 유리 |
| 2 L 유리병 | VWR International Ltd | 215-1596 | 붕규산 유리 |
| 2 L 유리 졸업 플라스크 | VWR International Ltd | BRND937254 | 붕규산 유리 |
| 어댑터, 공압, 8mm - 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | 산소 호스와 가스 분산 튜브 사이의 푸시-투-핏 직선 어댑터 |
| 알콕시 컨포멀 코팅 | Farnell | 1971829 | ACC15 페트리 접시 해부용 알콕시 컨포멀 코팅 |
| 마취제 | Chanelle | N/A | 이소플루란 흡입 마취제, 250mL 병 |
| 비커, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | 붕규산 유리 |
| 양극성 신경 커프 | Cortec GMBH | N/A | 800 미크론 내경, 수직 리드 아웃, 커넥터 종단 없음 |
| 보스헤드 | N/A | N/A | 막대에 그리퍼를 부착하기 위한 표준 습식 실험실 보스헤드 |
| 칼슘 이수화물 | 시그마 Aldrich | C7902-500g | 플라스틱 병에 500g |
| 카보겐 캐니스터 | BOC | N/A | F-크기 캐니스터 |
| 원심분리기 튜브, 15 mL 용량 | VWR International Ltd | 734-0451 | 팔콘 튜브 |
| 전도성 엘라스토머 신경 커프 | N/A | N/A | 자극을 위한 고충전 용량 신경 커프, 제작 참조 |
| 프로토콜 참조 커넥터, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | 이들은 악어 클립으로 종단된 와이어에 납땜해야 합니다(참조 항목 11) |
| 악어 클립 커넥터 | RS UK | 212-1203 | TermiMate 커넥터로 종단 된 와이어에 납땜해야합니다 (항목 10 참조) |
| 탈 이온수 | N / A | N / A | 탈 이온수 디스펜서에서 얻은 |
| 집게 45도 각도 | InterFocus Ltd | 91110-10 | 미세 집게, 학생 범위 |
| 집게 표준 Dumont # 7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | 학생 범위 집게 |
| 가스 디스person 튜브, 다공성 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| 무수 포도당, 분말 | VWR International Ltd | 101174Y | 플라스틱 병에 500g |
| 그리퍼 | N/A | N/ | A 표준 습식 실험실용 막대 장착형 그리퍼 |
| 교반기 | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| 지혈제 | N/A | N/ | A 길이 >12cm의 모든 지혈이 적합합니다 |
| 곤충 핀, 스테인리스 스틸, 크기 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| 노트북 컴퓨터 | N/A | / | A 사용하지 않는 USB 포트가 2개 이상 있는 실험실 안전 휴대용 컴퓨터가 적합합니다. |
| 라인 노이즈 필터 | 디지타이머 | N/A | 험버그 노이즈 제거기(50Hz 라인 노이즈 필터) |
| 저소음 프리앰프, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | 저잡음 전압 프리앰프 |
| 마그네슘 황산염 소금 | VWR International Ltd | 291184P | 플라스틱 병에 담긴 500g |
| MATLAB 스크립트 | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | 맞춤형 자극기 MATLAB 소프트웨어의 초기화, 교정 및 자극 스크립트 |
| Mathworks | N/A | 표준 패키지 | |
| 현미경 라이트, PL-2000 | Photonic | N/A | 백조 목이 있는 광원. 제품은 타사 공급업체인 |
| 현미경, SMZ 745 | Nikon | SM745 | 입체 현미경 |
| 미네랄 오일, 무독성 | VWR International Ltd | 31911.A1 | 신경 목욕 용 오일 |
| 목욕 | N/A | N/A | Plexiglas 기계 신경 욕조에서 얻을 수 있습니다. 자세한 내용은 프로토콜 참조. |
| 오실로스코프 | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. 제품은 제3자 공급업체로부터 얻을 수 있습니다 |
| . 산소 호스, 1 | BOC | N/A | 1/4" NPT 종결 |
| 산소 레귤레이터 | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| 연동 펌프 P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | 제품은 제3자 공급업체인 |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | 해당 사항 없음 |
| 염화칼륨 소금 | Sigma Aldrich | P5405-250g | 플라스틱 병에 250g |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 플라스틱 병에 250g |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330g, 암 |
| 참조 전극, ET072 | eDaQ(호주) | ET072-1 | 은염화은(은) 참조 전극 |
| 로드 | N/A | N/A | 스탠드용 피팅이 있는 표준 습식 실험실 막대 |
| 저울 | Sartorius | N/A | M-Power 저울, 분말 계량용. 제품은 타사 공급업체로부터 얻을 수 있습니다 |
| . 가위, 직선 12cm 가장자리 | InterFocus Ltd | , 91400-12 | 둔기-둔기 종단, 학생 범위 |
| , 신호 수집 장치, | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401, 다채널 ADC |
| 실리콘 그리스, 수 | 조 칸막이 밀봉용 | 무독성 Farnell | 3821559 |
| , 실리콘 튜브, 내부 2mm 직경 | N/A | N/ | A N/A |
| 실리콘 튜브, 5mm 내경 | N/A | N/A | / |
| A 은선 | Alfa Aesar | 41390 | 0.5mm, 어닐링 |
| 중탄산나트륨 소금 | Sigma Aldrich | S5761-500g | 플라스틱 병에 500g |
| 나트륨 VWR | International Ltd | 27810.295 | 플라스틱 병 |
| 1kg스프링 가위 각도 2mm 가장자리 | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| 스탠드 | N/A | N/A | 막대용 소켓이 있는 표준 습식 실험실 스탠드 |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 또는 맞춤형 자극기 (참조 참조) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | 가열 교반기와 함께 사용 |
| 사기 팁, 무딘, 직경 1mm | N/ A | N/A | N/A |
| 주사기 팁, 무딘, 2mm 직경 | N/A | N/A | / |
| A 주사기, 플라스틱, 10mL 용량 | N/A | N/A | 주사기에는 루어 잠금 피팅이 있어야 합니다 |
| 테이프, 방수 | N/A | N/ | A 작업대에 튜브 및 배선을 고정하기 위해 |
| 온도계 | VWR International Ltd | 620-0806 | 유리 온도계 |
| USB 전원 Bank | RS UK | 135-1000 | 맞춤형 자극기 전원 공급 장치, 실험 전에 완전히 충전하십시오. DS3 |
| 밸브, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | 목욕 공급 튜브에 주사기를 부착하고 사이펀을 프라이밍하기 위해 |
참고문헌
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M.
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