Method Article

위장 기질 종양의 유전자 조작 마우스 모델의 분자 및 면역 학적 기술

DOI:

10.3791/63853

⸱

May 2nd, 2022

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1Department of Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

In This Article

Summary

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이 원고의 목표는 키트V558Δ/+ 마우스 모델 및 마우스 표본의 성공적인 해부 및 처리를 위한 기술을 설명하는 것입니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위장 기질 종양 (GIST)은 가장 흔한 인간 육종이며 일반적으로 KIT 수용체의 단일 돌연변이에 의해 구동됩니다. 종양 유형 전반에 걸쳐 차세대 암 치료법을 조사하기 위해 수많은 마우스 모델이 개발되었습니다. 그러나, GIST에서, 대부분의 생체내 연구는 내 재된 한계를 갖는 이종이식편 마우스 모델을 사용한다. 여기에서, 우리는 키트V558Δ/+ 돌연변이를 보유하는 위장 기질 종양의 면역유능하고 유전적으로 조작된 마우스 모델을 기술한다. 이 모델에서, 대부분의 GIST를 담당하는 종양유전자인 돌연변이 KIT는 인간 GIST에서 볼 수 있는 조직학적 외관과 면역 침윤을 모방하는 GIST로 이어지는 내인성 프로모터에 의해 구동된다. 또한, 이 모델은 표적화된 분자 및 면역 요법 둘 다를 조사하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 여기에서는 키트V558Δ/+ 마우스 콜로니의 번식 및 유지에 대해 설명합니다. 또한이 논문은 GIST의 치료 및 조달, 키트V558Δ / + 마우스의 장간막 림프절 및 인접한 맹장의 배출 및 분자 및 면역 학적 분석을위한 샘플 준비에 대해 자세히 설명합니다.

Introduction

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GIST는 미국에서 약 6,000 건의 발생률을 보이는 인간에서 가장 흔한 육종입니다1. GIST는 Cajal의 간질성 세포로 명명된 위장관 심박조율기 세포로부터 유래하는 것으로 보이며, 전형적으로 티로신 키나아제 KIT 또는 PDGFRA2의 단일 돌연변이에 의해 구동된다. 수술은 GIST에 대한 치료의 주류이며 치료 적 일 수 있지만 진행성 질환 환자는 티로신 키나제 억제제 (TKI), 이마티닙으로 치료할 수 있습니다. 20 년 전에 도입 된 이래로, imatinib은 GIST의 치료 패러다임을 변화시켜 진행성 질병의 생존율을 1 년에서 5 년 이상 3,4,5 년 이상으로 향상 시켰습니다. 불행히도, imatinib은 획득 된 KIT 돌연변이로 인해 거의 치유되지 않으므로이 종양에 대한 새로운 치료법이 필요합니다.

마우스 모델은 암에서 새로운 치료법의 조사에 중요한 연구 도구입니다. 다중 피하 이종이식편 및 환자 유래 이종이식편 모델이 개발되고 GIST....

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Protocol

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모든 마우스는 NIH 지침과 펜실베니아 대학 IACUC의 승인에 따라 펜실베니아 대학에서 병원균이없는 조건 하에서 수용되었습니다. 안락사는 펜실베니아 대학 실험실 동물 자원 표준 운영 절차에 따라 수행되었습니다.

1. 키트V558Δ / + 마우스 번식

  1. 키트V558Δ/+ 마우스를 C57BL/6J 마우스를 C57BL/6J 마우스를 사용하여 C57BL/6J 배경으로 10회 이상 백크로스합니다. 이렇게하려면 수컷 키트V558Δ / + 마우스를 암컷 C57BL / 6J 마우스와 1 : 2 비율로 번식시킵니다.
    참고: 동형접합성 키트 V558 Δ/V558Δ 유전자형은 utero에서 치명적이다. 수컷 C57BL / 6J 마우스로 암컷 키트V558Δ / + 마우스를 번식시킬 수는 있지만 깔짚 크기는 암컷 야생형 C57BL / 6J 마우스에서 본 것보다 약 절반입니다. 또한, 암컷 키트V558Δ / + 마우스는 생후 4 개....

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Results

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키트V558Δ/+ 마우스 모델은 면역적격 마우스 모델에서 치료제의 조사를 가능하게 한다. 키트V558Δ/+ 마우스는 진행성 장 폐쇄로 인해 평균 수명이 8개월입니다(그림 4). 키트V558Δ/+ 마우스로부터의 종양은 티로신 키나제 키트 및 막횡단 채널 DOG1(도 5) 및 전사 인자 ETV1(도시되지 않음)을 포함하는 GIST의 정준 마커를 발현한다. 종양은 하류 마커인 ERK 및 AKT와 같은 KIT 신호전달 경로의 변화(도 6), 또는 인간 GIST

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Discussion

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키트V558Δ/+ 마우스 모델은 GIST의 분자 및 면역학적 분석에서 강력한 연구 도구입니다. 번식 전략에는 단일 교차가 필요하지만 종양 반응을 분석하는 실험에서 키트V558Δ / + 마우스 코호트를 사용하려면 광범위한 번식이 필요합니다. 마우스는 유사한 종양 중량을 보장하기 위해 연령 및 성별이 일치해야하며, 종양이 확립 될 때 생쥐의 10 %가 생후 8 주 전에 사망합니다. CT 또는 MRI와 같은 고급 이미징 기술을 사용하여 개별 마우스 내의 종양 부피를 추적하는 경우 덜 광범위한 번식 전략이 가능합니다. 그럼에도 불구하고, 키트V558Δ/+ 마우스는 다른 녹아웃 또는 유도성 마우스 모델로 성공적으로 교차되어, 중요한 면역 및 분자 메카니즘(12)을 드러냈다.

키트V558Δ/+ 마우스로부터의.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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키트V558Δ/+ 마우스는 Peter Besmer10 박사에 의해 유전자 조작되고 공유되었습니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01 CA102613 및 T32 CA251063에 의해 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 마이크론 필터EMSCO1194-2360
1x RBC 용해 버퍼Life Technologies00-4333-57
3mL 주사기Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences14823435
4– 15% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔, 10-well, 30 µ l바이오 라드4561083
4% 파라포름알데히드 용액Thermo Fisher ScientificAAJ19943K2
40 미크론 필터EMSCO1194-2340
5M NaCl시그마 AldrichS6546
70 미크론 필터EMSCO1194-2350
AKT 항체 (C67E7)세포 신호4691
C57BL/6J 마우스The Jackson Laboratory
Collagenase IVSigma AldrichC5138
Complete mini edta free protease inhibitorThomas ScientificC852A34
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher Scientific
일회용 메스Thermo Fisher Scientific/Exel International14-840-00
Dnase IThomas ScientificC756V81
Dog1 항체abcamab64085
EDTASigma AldrichE9884
ERK 항체 (p44/42)Cell Signaling9102
FBSThomas ScientificC788U23
FIJI 소프트웨어FIJIhttps://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 HomogenizerThermo Fisher Scientific15-340-169
HBSSUniversity of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylateSelleck ChemicalsS1026
KIT antibody (D13A2)Cell Signaling3074
KitV558Δ/+ GenotypingTransnetyx
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5mL)Thermo Fisher Scientific05-408-129
마우스 온 마우스 면역검출 키트, BasicVector LaboratoriesBMK-2202
니트로셀룰로오스 멤브레인, 프리컷, 0.45 &마이크로; mRio-Rad1620145
Nonfat Dry MilkThermo Fisher ScientificNC9121673
Nonidet P 40 SubstituteSigma Aldrich74385
p-AKT 항체 (S473)Cell Signaling4060
p-ERK 항체 (p44/42)Cell Signaling9101
p-KIT 항체 (Y719)Cell Signaling3391
PMSF 프로테아제 억제제Thermo Fisher Scientific36978
Proeinase KThermo Fisher ScientificBP170050
둥근 바닥 폴리스티렌 테스트(FACS) 튜브Falcon/Thermo Fisher Scientific14-959-2A
RPMI펜실베니아 대학교 세포 센터
불화나트륨(NaF)Sigma Aldrich
오르토바나데이트 나트륨(Na3VO4)Sigma AldrichS6508
SuperSignal West Dura Extended Duration SubstrateThermo Fisher Scientific34076
TBS 버퍼(10x)University of Pennsylvania Cell Center
조직 배양 접시(100mm2)Thermo Fisher Scientific/Falcon08-772E
TrisHCLThermo Fisher ScientificBP1757500
Tween 20Rio-Rad1706531
  vivaCT 80 플랫폼Scanco medical
201154

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
  2. Joensuu, H., DeMatteo, R. P.

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Gastrointestinal Stromal TumorGenetically Engineered MiceImmunocompetent Mouse ModelKit MutationTumor MicroenvironmentFlow CytometrySingle Cell SuspensionProtein IsolationTyrosine Kinase InhibitorsTumor Dissection

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