벤치탑 레오미터를 이용한 기도 점액의 신속한 점탄성 특성화

요약

점액의 점탄성 특성은 점액 제거에 중요한 역할을합니다. 그러나 전통적인 점액 유변학 기술은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 접근법이 필요합니다. 이 연구는 점탄성 측정을 신속하고 안정적으로 수행할 수 있는 벤치탑 레오미터의 사용에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

점막폐쇄성 폐 질환(예를 들어, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭포성 섬유증) 및 다른 호흡기 상태(예를 들어, 바이러스/박테리아 감염)에서, 점액 생물물리학적 특성은 잔 세포 과분비, 기도 탈수, 산화 스트레스 및 세포외 DNA의 존재에 의해 변화된다. 이전의 연구는 가래 점탄성이 폐 기능과 상관 관계가 있으며 객담 유변학 (예 : 점막 용해제)에 영향을 미치는 치료법이 놀라운 임상 적 이점을 초래할 수 있음을 보여주었습니다. 일반적으로, 비뉴턴 유체의 유변학적 측정은 분석을 수행하고 데이터를 해석하기 위해 광범위한 훈련이 필요한 정교하고 시간이 많이 걸리는 접근법(예를 들어, 병렬/원뿔 플레이트 레오미터 및/또는 마이크로비드 입자 추적)을 사용한다. 이 연구는 5분 이내에 임상 샘플에 대해 선형 점탄성 모듈리(G', G", G^*, tan δ) 및 겔 포인트 특성(γ c 및 σ_c)을 제공하기 위해 전단 스트레인 스윕을 통해 동적 진동을 사용하여 신속한 측정을 수행하도록 설계된 사용자 친화적인 벤치탑 장치인 Rheomuco의 신뢰성, 재현성 및 감도를 테스트했습니다. 장치 성능은 점액 시뮬란트, 8 MDa 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO)의 상이한 농도를 사용하여 및 전통적인 벌크 유변학 측정에 대해 검증되었다. 상태 천식 (SA)을 가진 삽관 환자로부터 수확 된 임상 격리물을 세 배 측정으로 평가 한 다음 측정 간의 변동 계수는 <10 %입니다. SA 점액 상에서 강력한 점액 환원제인 TCEP의 생체외 사용은 탄성 모듈러스의 다섯 배 감소와 전체적으로 더 "액체-유사한" 거동(예를 들어, 더 높은 황갈색 δ)을 향한 변화를 가져왔다. 함께, 이러한 결과는 테스트 된 벤치 탑 레오미터가 임상 및 연구 환경에서 점액 점탄성의 신뢰할 수있는 측정을 할 수 있음을 보여줍니다. 요약하면, 기술된 프로토콜은 점막성 약물(예를 들어, rhDNase, N-아세틸 시스테인)의 효과를 사례별로 또는 신규한 화합물의 전임상 연구에서 사례별로 적응시키기 위해 현장에서 효과를 탐구하는데 사용될 수 있다.

서론

천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭포성 섬유증 (CF) 및 바이러스 성 및 세균성 폐렴과 같은 기타 호흡기 질환을 포함한 점막 폐쇄성 기도 질환은 전 세계적으로 널리 퍼진 건강 문제입니다. 병태생리학은 각 조건마다 크게 다르지만, 공통적인 주요 특징은 비정상적인 점막염 제거이다. 건강한 폐에서 점액은 기도 상피를 정렬하여 흡입 된 입자를 포획하고 병원균에 대한 물리적 장벽을 제공합니다. 일단 분비되면, ~97.5%의 물, 0.9%의 염, ~1.1%의 구상 단백질, 및 ~0.5%의 뮤신으로 구성된 기도 점액은 섬모 ^1,2의 조정된 박동에 의해 점차적으로 응고염 쪽으로 수송된다. 뮤신은 점액의 뚜렷한 점탄성 특성을 제공하기 위해 비공유 및 공유 결합을 통해 상호작용하는 큰 O-결합 당단백질이며, 이는 효율적인 수송을 위해 요구된다³. 변경된 이온 수송, 뮤신 언폴딩, 정전기적 상호작용, 가교결합, 또는 조성의 변화로 인한 뮤신 네트워크의 초구조의 변화는 점액 점탄성에 유의하게 영향을 미치고 점액 클리어런스를 손상시킬 수 있다^4,5....

프로토콜

본 연구에서, 샘플은 UNC 기관 검토 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 정보에 입각한 동의를 얻은 후 임상적으로 지시된 기관지 내시경 검사 동안 수집되었다.

1. 가래 / 점액 수집 및 저장

1. 가래 수집 또는 기관지 내시경 흡인을 통해 기도 점액을 수집하십시오.
   1. 자발적인 거담을 통해 가래를 수집하거나 3 % 고장성 생리 식염수 흡입으로 가래를 유도하십시오. 또는 기관지 내시경 검사 절차 중에기도에서 점액을 직접 흡인하십시오.
   2. 수집 된 기도 가래 / 점액을 멸균 표본 컵에 보관하십시오. 가래의 경우, 수집 즉시 샘플에서 과도한 타액을 제거하십시오.
   3. 운반을 위해 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 전송 시간을 4시간 미만으로 제한하십시오.
2. 수집 시에 샘플을 분석하거나 처리될 때까지 -80°C에서 저장한다.
   1. 보관하기 전에 미세 원심분리 튜브에 직접 포지티브 변위 피펫 또는 피펫으로 세 번에서 다섯 번 부드럽게 피펫팅하여 점액을 균질화하십시오.
   2. 실험을 위한 충분한 부피를 보장하기 위해 샘플을 ≥500 μL의 부피로 분취한다.
      참고: 동결 및 ....

결과

도 1은 점탄성 대조군, 즉 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 용액, 및 천식 상태(SA) 점액의 농도 의존적 곡선을 이용한 유변학적 측정의 정확도 및 반복성을 보여준다. 5가지 농도(1%, 1.5%, 2%, 2%, 2.5%, 및 3%)에서 8 MDa PEO의 점탄성 특성의 측정은 평가된 벤치탑 레오미터와 전통적인 벌크 레오미터 사이에서 직접 비교되었다(표 재료). SA 점액과는 달리, PEO 용액은 전체 균주 범위에서 점성 우세(G" > G')였고, 크로스오버를 나타내지 않았고, 따라서 고체-유사 거동을 나타내었다. 또한, 1.5% PEO 용액 및 임상 SA 점액 샘플에서 수행된 삼중 측정은 생물학적 샘플로부터 수득된 값에 대해 선형 점탄성 특성(G*, G' 및 G")이 매우 반복적(<10% 변동 계수)임을 확인하였다.

SA 환자의 로바 붕괴 관찰은 .......

토론

점액의 독특한 점탄성 특성은 건강한 기도를 유지하는 데 필수적입니다. 내부 및 외부 요인은기도 점액 생물 물리학 적 특성을 변화시켜 점막 폐쇄성 질환의 특징적인 임상 합병증을 일으킬 수 있습니다. 따라서 점액 점탄성의 변화를 모니터링하는 것은 질병 상태 평가 및 점액 점탄성을 감소시키는 치료법의 탐구 중에 고려 될 수 있습니다. 1980 년대의 경험적 연구는 자기 비드 레오 미터^23,24를 사용하여 점액 유변학과기도 클리어런스 사이의 강한 상관 관계를 입증^했습니다. 최근 몇 년 동안, 유변학은 다양한 규모로 점액을 분석하는 몇 가지 기술을 활용하기 위해 진화했습니다. 예를 들어, 현미경 분석은 현미경 프로브를 사용하여 자성 또는 형광 마이크로미터 크기의 입자의 이동에 기초한 국소 점액 특성을 기술합니다. 그러나 이 기술은 작은 샘플 부피를 활용하기 때문에 객담과 같은 이기종 샘플을 설명하는 대표적인 데이터를 얻기가 어려울 수.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
모세관 피스톤 팁	Gilson	CP1000
Discovery 하이브리드 유변계-3	TA Instruments		DHR-3 벌크 유변계는 델라웨어주 뉴캐슬에 있는 TA Instruments에서 제조 : 유변학 테스트를 수행하는 데 사용됩니다.
그래프 소프트웨어	GraphPad 프리즘		GraphPad 소프트웨어 (샌디에이고, 캘리포니아) 데이터 분석에 사용
마이크로 원심 분리기 튜브	Costar	3621
펠티에 플레이트	TA Instruments		제어 시스템 뉴 캐슬의 TA Instruments에서 제조
DE 폴리에틸렌 옥사이드	시그마	372838	점액 모사제로
사용되는 8 MDa 폴리머용적식 피펫	Gilson	M1000	피펫은 점성 용액
Rheomuco	Rheonova		벤치탑 유변성 용액 처리에 사용되며 프랑스의 Rheonova에서 제조한 탁상용 유변성계: 유변학 테스트를 수행하는 데 사용됩니다.
거친 하부 형상	Rheonova	D-1811-007	25mm 직경
거친 상부 형상	Rheonova	U-1811-007	25mm 직경
부드러운 상부 병렬 플레이트	TA Instruments		20mm 직경
트리스(2-카르복시에틸)포스핀	시그마	646547-10X1ML	TCEP: 강력한 환원제.

온도