본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
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방법 논문
트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징
이 논문에서
요약
초록
샤 가스 병은 주로 라틴 아메리카에서 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 무시 된 병리학입니다. 샤가스병 치료제인 트리파노소마 크루지 (T. cruzi)는 인간을 포함한 여러 포유류 종을 감염시켜 심장 및 소화기 병리를 유발하는 다양한 생물학을 가진 절대 세포 내 기생충입니다. 샤가스병의 복잡한 생물학을 이해하고 치료 요법의 결과를 정확하게 평가하기 위해서는 T. cruzi in vivo 감염의 신뢰할 수 있는 검출이 오랫동안 요구되어 왔습니다. 현재 프로토콜은 3D 재구성 및 제거 된 장기에서 T. cruzi 감염 세포의 자동 정량화를위한 통합 파이프 라인을 보여줍니다. 라이트 시트 형광 현미경을 사용하면 전체 장기 또는 조직에서 활발하게 증식하고 휴면 상태인 T. cruzi 기생충과 면역 이펙터 세포를 정확하게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 또한 항체 및 핵 염색으로 제거 된 장기의 균일 한 표지를 얻기위한 CUBIC-HistoVision 파이프 라인이 성공적으로 채택되었습니다. 3D 면역염색과 결합된 조직 투명화는 약물 치료 프로토콜을 종합적으로 평가하고 T. cruzi 감염 조직의 세포 조직에 대한 이해를 향상시키는 편견 없는 접근 방식을 제공하며 샤가스병의 항-T. 크루즈 면역 반응, 조직 손상 및 복구와 관련된 발견을 발전시킬 것으로 기대됩니다.
서론
원생동물 기생충 T. cruzi에 의해 발생하는 샤가스병은 세계에서 가장 방치된 열대성 질병 중 하나이며 연간 약 13,000명이 사망합니다. 감염은 종종 부정맥, 심부전 및 갑작스런 사망을 포함하여 환자의 30 %에서 심장 병리를 일으키는 급성에서 만성 단계로 진행됩니다 1,2. 급성기 동안 기생충에 대해 유도 된 강력한 숙주 면역 반응에도 불구하고, 적은 수의 기생충이 심장 및 골격근과 같은 조직에서 숙주의 평생 동안 만성적으로 지속됩니다. 적응 면역 반응의 지연된 발병 및 비 복제 형태의 기생충의 존재를 포함한 몇 가지 요인은 면역계 3,4,5,6에 의한 완전한 제거를 피하기 위해 T. cruzi의 능력에 기여할 수 있습니다. 또한, 복제되지 않는 휴면 형태의 기생충은 트리파노시드 약물에 대한 낮은 감수성을 나타내며 많은 경우 7,8
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프로토콜
이 연구는 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 실험실 동물 관리 인증 지침의 평가 및 인증 협회에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 동물 사용 프로토콜(마우스의 T. cruzi 감염 통제-A2021 04-011-Y1-A0)은 조지아 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 나6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 및 C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J 마우스(암컷,1-2개월)를 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다(재료 표 참조).
1. 감염, 관류 및 해부
- 각각 tdTomato 또는 GFP 형광 단백질을 발현하는 콜롬비아나(DTU TcI) 또는 브라질(DTU TcV) T. 크루지 균주의 조직 배양 유래 트리포마스티고테로 마우스를 복강 내 감염시킵니다. 감염 용량은 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) 100μL에 희석 된 50,000에서 200,000 트리포 마스 티고 테의 범위 일 수....
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결과
CUBIC 고정 조직을 PBS로 세척하여 고정액을 제거한 다음 조직에서 색소와 지질을 추출하는 아미노 알코올의 기본 완충 용액인 CUBIC-L 칵테일과 함께 배양하여 조직 구조를 유지하면서 조직을 탈색시켰습니다. 종이의 격자 선은 장기의 적절한 청소를 나타내는 조직을 통해 볼 수 있습니다 (그림 2A). 탈지화 후, 조직을 세척하고, RI 균질화 및 이미징을 위한 CUBIC-R+ 및 장착 용액에 각각 침지시켰다(도 2B).
야생형 마우스를 DiR 근적외선 시아닌 염료로 미리 염색된 td토마토 발현 트리포마스티고테에 감염시켰다. 마우스는 감염 후 15일 후에 안락사되었고, 온전한 심장은 해부, 고정 및 제거되었습니다. LSFM 이미징 및 3D 재구성을 통해 td토마토 발현 증식 T. cruzi 기생충.......
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토론
기생충과 면역 반응에 대한 광범위한 전체 장기 영상의 부재는 숙주-기생충 상호 작용의 복잡성에 대한 이해를 제한하고 샤가스병에 대한 치료법의 평가를 방해합니다. 본 연구는 T. cruzi에 감염된 마우스의 손상되지 않은 장기와 조직을 명확히하고 염색하기 위해 CUBIC 파이프 라인을 채택했습니다.
이 연구에서 여러 조직 투명화 프로토콜이 테스트되었습니다 (PACT32,ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 및 fDISCO13). 그러나 CUBIC 만이 높은 수준의 tdTomato 또는 GFP 기생충 형광을 보존했습니다. 유사하게, 이전의 보고는 다른 조직-투명화 접근법과 비교하.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
조직 투명화 및 면역염색 프로토콜에 관한 귀중한 도움과 권장 사항에 대해 Etsuo Susaki 박사에게 감사드립니다. 또한 LSFM 및 컨포칼 이미징을 사용한 기술 지원에 대해 CTEGD Biomedical Microscopy Core의 M. Kandasamy에게 감사드립니다. 또한이 연구 전반에 걸쳐 유용한 제안을 해주신 Tarleton Research Group의 모든 구성원에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1-메틸이미다졸 | 밀리포어, 시그마 | 616-47-7 | |
| 2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론(안티피린, | TCI, | D1876 | |
| 6-웰, 세포 배양 플레이트 | ThermoFisher Scientific | , 140675 | |
| AlexaFluor 647, 안티-마우스 Fab 단편 | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647, 안티-토끼 팹 단편 | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6. C+A2:A44G-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 마우스 | 잭슨 연구소 | 균주 #007914 | 일반 이름: Ai14, Ai14D 또는 Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J 마우스 | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J 마우스 | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common 이름: Cd8A-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| 청소용 물티슈 Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D 면역 염색 키트 | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D 핵 염색 키트 | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| 시아노아크릴레이트 기반 겔 초강력 571605 | 치 | DiR | |
| (DiIC18(7); 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide) 회사: Biotium | Biotium | #60017 | |
| 에틸렌 디아민 테트라 아세트산(EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon 원심분리기 튜브 15mL | Corning | ||
| Falcon 원심분리기 튜브 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920. BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 또는 #H4272 | |
| Imaris 파일 변환기 x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris 소프트웨어 | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector 소프트웨어 | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| 정맥 주사 바늘 23-G | Sartori, Minisart 주사기 필터 | 16534 | |
| Kimwipes | 보푸라기 없는 물티슈 | ||
| 라이트 시트 형광 현미경 | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II 이미징 시스템 | |
| 메탄올 | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| 마이크로피펫 팁, 10 &마이크로; L, 200 &마이크로; L 및 1,000 &마이크로; L | Axygen | T-300, T-200-Y 및 T-1000-B | |
| 전동 피펫 디스펜서 | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| 장착 솔루션 | TCI | M3294 | |
| N-부틸디에탄올아민 | TCI | B0725 | |
| 니코틴아미드 | TCI | N0078 | |
| N-메틸니코틴아미드 | TCI | M0374 | |
| 파라포름알데히드(PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| 혈청학 피펫 | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| 탄산수소나트륨(NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G 녹색 핵산 염색 | 제 ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T8787 |
참고문헌
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleto....
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