이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

동적 세포 배양을 위한 출구 분별과 통합된 다중 스트림 관류 생물반응기

2.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63935

⸱

2022년 7월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biochemical Engineering, Rutgers University, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Medicine, Rutgers Biomedical Health Sciences

이 논문에서

요약

이 논문은 세포 과정에서 용질의 분비 및 흡수 속도의 역학을 측정하기 위한 저비용의 다채널 관류 세포 배양 시스템을 구축하고 운영하는 방법을 제시한다. 시스템은 또한 세포를 동적 자극 프로파일에 노출시킬 수 있다.

초록

특정 세포 및 조직 기능은 기존의 배양 시스템에 의해 제대로 해결되지 않는 분에서 시간의 동적 시간 척도 내에서 작동합니다. 이 작업은 배양 배지를 세포 배양 모듈에 지속적으로 관류하고 다운스트림 모듈에서 분획하여이 규모의 역학을 측정 할 수있는 저비용 관류 생물 반응기 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 거의 전적으로 상업적으로 이용 가능한 부품으로 구성되며 병렬화되어 기존의 다중 웰 세포 배양 플레이트에서 동시에 독립적 인 실험을 수행 할 수 있습니다. 이 비디오 기사에서는 단일 다중 채널 주사기 펌프와 최대 여섯 개의 배양물을 병렬로 관류하기 위해 수정된 분획 수집기만 있으면 되는 기본 설정을 조립하는 방법을 보여 줍니다. 모듈형 설계에 유용한 변형이 또한 제시되어 용질 펄스 또는 약동학적 유사 프로파일과 같은 제어된 자극 역학을 허용한다. 중요한 것은 용질 신호가 시스템을 통과할 때 용질 분산으로 인해 왜곡된다는 것입니다. 또한, MATLAB을 사용하여 트레이서를 사용하여 관류 설정의 구성 요소의 체류 시간 분포(RTD)를 측정하는 방법이 설명된다. RTD는 다중 구획 시스템의 흐름에 의해 용질 신호가 어떻게 왜곡되는지 계산하는 데 유용합니다. 이 시스템은 매우 견고하고 재현 가능하므로 기본 연구원은 전문 제조 시설 없이도 쉽게 채택 할 수 있습니다.

서론

많은 중요한 생물학적 과정은 세포 및 조직 배양물에서 분 내지 시간 1,2,3의 시간 척도에서 일어난다. 이러한 현상 중 일부는 타임랩스 현미경4, 생체발광1 또는 기타 방법을 사용하여 자동화된 방식으로 관찰되고 기록될 수 있지만, 화학 분석을 위해 배양 상등액 샘플의 수집을 포함하는 실험은 종종 정적 세포 배양물에서 수동으로 수행됩니다. 수동 샘플링은 빈번한 또는 근무 후 샘플링 시간대의 불편 함으로 인해 특정 연구의 실현 가능성을 제한합니다. 정적 배양 방법의 또 다른 단점은 화학 자극에 대한 통제되고 일시적인 노출을 포함하는 실험을 포함한다. 정적 배양에서, 자극은 수동으로 추가 및 제거되어야 하며, 자극 프로파일은 시간에 따른 단계 변화로 제한되는 반면, 배지 변경은 또한 통제되지 않는 방식으로 세포에 영향을 미칠 수 있는 다른 배지 성분을 추가 및 제거한다5. 유체 시스템은 이러한 문제를 극복 할 수 있지만 기존 장치는 다른 문제를 제기합니다. 미세 유체 장치는 생산 및 사용을위한 특수 장비 및 교육의 엄청난 비용을 수반하며, 샘플을 처리하기 위해 미세 분석 방법이 필요하며 관류 후 세포가 장치에서 복구하기가 어렵습니다6. 7,8,9,10에 설명 된 실험 유형을 위해 매크로 유체 시스템이 거의 만들어지지 않았으며 사내에서 제작 된 여러 맞춤형 부품으로 제작되었으며 여러 펌프 또는 분수 수집기가 필요합니다. 또한, 저자들은 현탁 배양을 위한 교반 탱크 생물반응기 이외의 상업적으로 이용가능한 거대유체 관류 세포 배양 시스템을 알지 못하지만, 이는 생리학을 모델링하고 연구하기 위해 설계되지는 않았지만, 바이오제조에 유용하다.

저자들은 이전에 거의 전적으로 상업적으로 이용가능한 부분들(11)로 구성된 저비용 관류 생물반응기 시스템의 설계에 대해 보고하였다. 시스템의 기본 버전은 웰 플레이트의 여러 배양물을CO2 인큐베이터에 보관하고 시린지 펌프의 배지와 지속적으로 관류할 수 있게 하며, 배양물로부터의 유출 배지 스트림은 맞춤형 변형을 통해 분획 수집기를 사용하여 시간이 지남에 따라 샘플로 자동 분획됩니다. 따라서, 이 시스템은 배양 배지 상청액의 자동 샘플링 및 시간에 따른 배양물에 대한 연속 용질 투입을 가능하게 한다. 이 시스템은 거대 유동적이고 모듈식이며 새로운 실험 설계의 요구를 충족시키기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.

여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 시간에 따른 세포에 의한 물질의 분비 또는 흡수 속도가 측정되고 / 또는 세포가 정확하고 일시적인 용질 신호에 노출되는 실험을 가능하게하는 관류 세포 배양 시스템을 구성, 특성화 및 사용하는 것입니다. 이 비디오 기사에서는 단일 주사기 펌프와 변형된 분획 수집기를 사용하여 최대 여섯 개의 세포 배양물을 동시에 관류할 수 있는 기본 설정을 조립하는 방법을 설명합니다. 짧은 펄스 및 약동학 유사 프로파일(12)을 포함하는 세포를 일시적인 용질 농도 신호에 노출시키는 실험을 허용하기 위해 추가적인 펌프 및 부품을 사용하는 베이스 시스템 상의 두 가지 유용한 변이체가 또한 도 1에 제시된다.

figure-introduction-1
그림 1: 관류 시스템 설계의 세 가지 변형 . (Top) 기본 관류 시스템. (중간) 여러 매체 소스에 대한 스톱콕이있는 관류 시스템. (하단) 교반된 탱크를 갖는 관류 시스템은 잘 혼합된 부피의 분포를 모방한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

흐름 내의 분산 및 확산으로 인해 용질 신호는 흐름 시스템을 통과 할 때 왜곡되거나 "번짐"됩니다. 이러한 왜곡은 체류 시간 분포(RTD)13의 사용을 통해 정량화될 수 있다. 이 문서에서는 관류 시스템의 구성 요소에 대한 추적기 실험을 수행하는 방법을 설명하고(그림 2), 측정된 데이터에서 RTD를 생성하는 MATLAB 스크립트를 제공합니다. 이 분석에 대한 자세한 설명은 저자의 이전 논문11에서 찾을 수 있습니다. 추가적인 MATLAB 스크립트는 RTD에 적절한 기능을 적합시키고 물리적 파라미터를 추출하고, RTD를 사용하여 신호 컨볼루션을 수행하여 사용자에 의해 입력된 용질 신호가 관류 시스템(14)을 통해 어떻게 전파되고 왜곡되는지를 예측한다.

figure-introduction-2
그림 2: 체류 시간 분포. 이 튜브 길이와 같은 흐름 시스템 구성 요소의 RTD는 트레이서의 펄스를 시스템에 입력하고 수집 된 분획으로 빠져 나올 때까지 "번짐"을 측정하여 측정됩니다. 이 수치는 Erickson et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 우물 격판덮개 관류를 위한 부속을 준비하십시오

  1. 튜브 준비
    1. 각 세포 배양물이 관류되도록 두 개의 길이의 실리콘 튜빙(1.6 mm 내경)을 절단한다. 업스트림 튜빙으로 사용되는 조각이 주사기 펌프에서 인큐베이터 내부의 세포 배양까지 도달하기에 충분히 길고, 하류 조각이 세포 배양물에서 분획 수집기의 가장 먼 확장 위치까지 도달 할 수 있는지 확인하십시오.
    2. 튜브의 각 조각에 라벨이 붙은 테이프로 양쪽 끝에 고유 한 라벨을 붙이십시오.
  2. 우물 접시를위한 마개 준비
    1. 관류될 웰 플레이트의 각 웰에 대해 하나의 실리콘 마개를 얻고, 밀폐된 씰로 웰에 꼭 맞도록 적절한 직경을 가집니다.
    2. 마개 바닥에서 과도한 물질을 차단하여 우물에 맞게하고 의도 한 액체 수준 이상의 공기를 위해 내부 공간을 남겨 둡니다.
    3. 두 개의 둔한 18G 바늘을 각 마개를 통해 아래쪽에서 위쪽과 바깥쪽으로 밀어 넣어 우물을 통과하는 흐름의 입구 및 출구 역할을하며 서로 정반대쪽으로 이동하여 우물 내의 팁 사이의 거리를 극대화하십시오.
    4. 출구 바늘의 높이가 관류 중에 우물에있는 액체 수준의 안정된 높이를 결정하기 때문에 플러그가 달린 우물 내의 바늘의 높이를 조정하십시오.
      참고 : 관류가 액체 레벨 위의 출구 바늘로 시작되면 레벨이 바늘에 도달 할 때까지 액체가 우물에 축적됩니다. 관류가 액체 레벨 아래의 출구 바늘로 시작되면, 기포가 우물로 흘러 들어가지 않는 한 액체 레벨은 일정하게 유지되며, 이로 인해 액체 높이가 출구 바늘과 동일한 높이가 될 때까지 낮아집니다.
  3. 추가 부품 수집
    1. 전체 관류를 위한 충분한 배지를 함유하기에 충분히 큰 각각의 세포 배양물에 대해 하나의 멸균 주사기를 수득하고, 초기에 튜빙을 채우기 위한 추가의 양의 배지를 포함한다.
    2. 각 배양물을 관류하려면 암컷 대 미늘 한 개와 남성 대 바브 루어 커넥터 두 개와 여성 및 남성 루어 캡 두 개를 얻으십시오.
  4. 부품을 청소하고 살균하십시오.
    1. 이전에 부품을 사용한 적이 있다면 0.1 N NaOH로 관류하여 닦은 다음 탈이온수로 헹구십시오.
    2. 오토클레이빙 또는 다른 방법으로 위에 나열된 모든 부품의 멸균성을 보장하십시오.

2. 멀티 헤드 디스펜서를 레이저로 자르고 분수 수집기에 부착하십시오.

  1. 그림 3의 다중 헤드 디스펜서 모델을 컴퓨터 지원 설계 프로그램에서 다시 생성하거나 제공된 모델 DXF 파일(보충 파일 1)을 다운로드합니다.
  2. 레이저 커터를 사용하여 아크릴 시트의 1/8에서 디자인을 자릅니다.
  3. 분배 헤드를 분수 컬렉터의 이동 베이스에 부착하는 세 개의 나사를 분리합니다.
  4. 멀티 헤드 디스펜서의 가장 작은 구멍 세 개를 이동 베이스의 나사 구멍에 맞추고 나사를 구멍을 통해 다시 조여서 부착합니다.
  5. 세 개의 나사의 조임새를 조정하여 분배 구멍의 행이 그 아래의 수집 튜브와 정렬될 때까지 다중 헤드 디스펜서를 위아래로 기울입니다.
  6. 300 μL 피펫 팁을 원하는 구멍을 통해 조심스럽게 배치하여 분배 팁으로 사용하십시오.
    참고: 분획 수집기는 단일 세포 배양물을 관류하기 위해 다중 헤드 디스펜서 없이 사용될 수 있다.

3. 컴포넌트 RTD 측정 및 신호 컨볼루션 수행

  1. 그림 2와 같이 트레이서 펄스용 펌프와 주사기를 설정합니다.
    1. 두 개의 단일 채널 또는 다중 채널 주사기 펌프를 확보하십시오.
    2. 세포 배양 실험 동안 유동 시스템에서 사용될 배지를 나타내기 위해 배경 용액을 선택하십시오. 배경 용액이 매체와 유사한 질량 전달 특성을 갖는지 확인하십시오. 많은 경우에, 탈이온수는 적절한 선택이다.
    3. 세포 배양 실험 중에 관심을 가질 용질을 나타내는 트레이서 물질을 선택하십시오. 추적기가 관심있는 용질과 유사한 질량 전달 특성을 가지며 그 농도를 측정 할 수 있어야합니다. 많은 경우, 식품 염료는 적절한 선택입니다.
    4. 트레이서 물질을 배경 용액에 용해시켜 트레이서 용액을 만듭니다.
    5. 하나의 주사기를 배경 용액으로 채우고 하나의 주사기 펌프에로드하십시오. 다른 주사기를 트레이서 용액으로 채우고 두 번째 주사기 펌프에 적재하십시오.
    6. Luer 커넥터를 사용하여 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결합니다.
    7. 스톱콕을 배경 용액으로 닫고 트레이서 용액을 열린 포트에서 떨어지기 시작할 때까지 스톱콕에 펌핑하십시오. 펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오.
      참고: 주사기 펌프의 이동 막대가 실험의 시간 초과 부분이 시작되기 전에 주사기 플런저에 대해 위로 밀려나는 것이 중요합니다. 이렇게하면 펌프가 시작될 때 즉시 흐름이 시작될 수 있습니다. 그렇지 않으면, 펌프가 시작될 수 있지만, 이동 막대가 플런저 위치까지 따라잡을 때까지 흐름이 실제로 시작되지 않을 것이다.
    8. 트레이서 용액에 스톱콕을 닫고 모든 잔류 트레이서 용액이 열린 포트에서 플러시될 때까지 배경 용액을 스톱콕으로 펌핑합니다. 펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오.
  2. 관심 있는 흐름 시스템 구성 요소와 분수 수집기 설정
    1. RTD 분석에 원하는 흐름 시스템 구성 요소를 설정합니다. 측정될 부품이 작동 중에 분수 수집기에 도달하기에 적합한 길이와 유연성의 다운스트림 튜브 조각으로 끝나도록 하십시오.
    2. 다운스트림 튜브의 끝을 멀티 헤드 디스펜서의 피펫 팁 디스펜서에 삽입하여 단단히 연결되도록 합니다.
    3. 네 방향 스톱콕의 열린 포트를 측정할 구성 요소의 입구에 연결합니다. 배경 용액을 세포 배양 실험 동안과 같이 완전히 채워질 때까지 성분을 통해 펌핑하고, 분획 수집기 분배 팁에서 물방울을 흘리기 시작한다. 펌프를 중지하십시오.
  3. 트레이서 펄스를 주입하고, 분수를 수집하고, 트레이서 측정
    1. 트레이서 용액의 펌프를 원하는 유량으로 설정하십시오. 백그라운드 솔루션에 대한 stopcock을 닫고 트레이서 솔루션의 흐름을 시작하십시오. 동시에 분수 수집기를 시작하십시오.
    2. 트레이서 솔루션의 흐름을 짧은 시간 동안 계속하여 트레이서의 임펄스 입력을 근사화합니다. 10분의 펄스 지속 시간은 1mL/h의 유속으로 RTD에 대해 잘 작동하는 것으로 밝혀졌다.
      참고: 트레이서 펄스가 너무 짧으면 추적기가 충분하지 않아 측정 가능한 흐름에 들어갑니다. 펄스가 너무 길면 더 이상 임펄스를 근사하지 않으며 RTD의 모양이 변경됩니다.
    3. 트레이서 솔루션 펄스 기간이 끝나면 트레이서 솔루션 펌프를 중지하십시오. 트레이서 솔루션에 대한 스톱콕을 빠르게 닫고 동일한 유속으로 배경 솔루션의 흐름을 시작하십시오.
    4. 배경 용액이 흐르도록 허용하고 모든 트레이서가 시스템을 통과하여 수집 된 분획으로 들어갈 때까지 분획을 수집하십시오.
    5. 시스템을 중지하고 분획의 트레이서 농도를 측정하십시오. 완전히 분배 된 분수 만 포함하십시오. 분수 수집을 통해 수집이 부분적으로 중지되면 해당 분수를 포함하지 마십시오.
  4. MATLAB에서 측정된 데이터로부터 체류 시간 분포(RTD) 계산
    참고: 이 MATLAB 스크립트에 의해 수행된 분석에 대한 서면 설명은 저자의 이전 간행물11에서 찾을 수 있으며, 이론에 대한 논의는 문헌13에서 널리 이용 가능하다.
    1. 보충 파일 2에 제공된 .xlsx 스프레드시트 형식으로 농도 데이터가 포함된 example_tracer_data.xlsx 파일을 생성합니다. 2행의 왼쪽에서 오른쪽으로 시간순으로 분수(모든 단위)에 트레이서의 농도 값을 입력합니다. 펄스의 시작부터 A5 셀의 마지막 분획의 끝까지 경과된 시간을 입력하고 A8 셀에 트레이서 펄스의 길이를 분 단위로 입력합니다.
    2. .xlsx 파일을 MATLAB 디렉토리에 저장합니다.
    3. MATLAB 편집기에서 보충 파일 3에서 RTD_From_Data.m 스크립트를 엽니다.
    4. 스크립트 파일에 작성된 지침에 따라 스크립트의 데이터 로드 섹션의 첫 번째 줄에 있는 괄호 안에 있는 .xlsx 파일의 이름을 새 .xlsx 데이터 파일의 이름으로 바꿉니다. 스크립트를 실행합니다.
    5. 스크립트가 RTD 분석13을 성공적으로 수행하여 RTD의 플롯을 생성하고 RTD와 동일한 1에 대한 숫자 적분 값을 반환하는지 확인하십시오. 스크립트가 MATLAB 디렉토리에 저장한 시간 벡터(t) 및 연관된 RTD 값 벡터(Et)를 찾습니다.
  5. 모델 함수를 MATLAB의 RTD에 맞추기
    1. 보충 파일 4에서 MATLAB 편집기에서 Fit_RTD_Function.m 스크립트를 엽니다.
    2. RTD에 맞게 세 가지 주석 처리 된 모델 기능 중 하나를 선택하십시오 : 원통형 튜브의 층류에 RTD에 맞는 축 분산 모델13; 잘 교반 탱크에 맞는 CSTR 모델13; 및 n-CSTR 모델15를 포함하는데, 이는 대략 더 큰 웰 플레이트에 적합하다. 여기에 포함되지 않은 다른 모델에 맞게 동일한 형식으로 스크립트에 추가합니다.
    3. 피팅을 위해 선택한 모델이 포함된 스크립트 섹션에서 주석을 제거합니다.
    4. 매개변수에 대한 초기 추측의 값을 RTD에 적합한 값으로 변경합니다.
    5. 스크립트를 실행하여 RTD 데이터에 오버레이된 fit 함수의 플롯을 생성하고 함수에 대한 fit 매개변수 값을 인쇄합니다. 적합도가 매우 좋지 않거나 오류가 발생하면 매개 변수 초기 추측을 변경하고 스크립트를 다시 실행합니다.
  6. MATLAB에서 신호 컨볼루션 수행
    1. 하나의 신호와 하나의 RTD 또는 두 개의 RTD를 선택하여 컨볼브합니다.
    2. MATLAB 편집기에서 보충 파일 5에서 Signal_Convolution.m 스크립트를 엽니다.
    3. 컨볼브될 두 신호들 각각(즉, 하나의 신호와 하나의 RTD, 또는 두 개의 RTD들)에 대해, 원하는 유닛들 내에 균등하게 이격된 시점들의 하나의 벡터와 그 시간들에서의 신호 값들의 대응하는 벡터를 정의한다.
      참고: 두 신호의 벡터는 동일한 수의 요소와 동일한 크기 시간 단계를 가져야 합니다. 그렇기 때문에 RTD를 임의의 수의 포인트에 대해 언제든지 샘플링 할 수있는 연속 함수로 사용하는 것이 유용합니다.
    4. 두 신호를 MATLAB에 입력하고 스크립트를 실행하여 출력 신호의 시간 및 신호 벡터를 가져옵니다.

4. 우물 접시에 세포가있는 기본 관류 시스템 설정

  1. 웰 플레이트 준비
    1. 웰 플레이트 배양물이 관류 실험을 위한 적절한 배지 깊이를 갖는지 확인한다. 관류를 시작하기 전에 원하는 대로 최종 배지 변경, 자극 또는 기타 단계를 수행합니다. 현탁액 세포가 관류되는 경우, 플레이트가 바닥에 있는지 확인하기 위해 플레이트를 원심 분리하십시오.
    2. 멸균 조건 하에서, 바늘이 있는 마개를 바늘을 뽑아 웰 플레이트 배양물에 삽입한다. 마개가 제자리에 놓인 후, 출구 바늘의 높이가 안정한 액체 수준을 결정하기 때문에 관류를 위해 바늘을 원하는 높이로 낮추십시오.
    3. 바늘을 수컷 루어 캡으로 뚜껑을 덮고 사용할 때까지 전체 우물 플레이트를 인큐베이터에 보관하십시오.
  2. 주사기와 업스트림 튜브 준비
    1. 멸균 조건 하에서, 각 배양물에 대해 하나의 주사기를 채워 관류의 원하는 기간 동안 충분한 배지로 관류시키고, 상류 튜빙을 채우기에 충분한 추가 배지를 채운다.
    2. 암-헛간 Luer 커넥터를 사용하여 업스트림 튜브를 주사기에 부착하십시오. 튜브의 다른 쪽 끝에 수컷-바브 Luer 커넥터를 삽입합니다.
    3. 상류 튜브가 완전히 배지로 채워질 때까지 주사기로부터 배지를 분배한다.
    4. 튜브의 열린 끝을 여성 루어 캡으로 캡하십시오.
      참고: 모든 복제 주사기는 이 시점에서 정확히 동일한 부피를 가져야 합니다. 볼륨이 동일하지 않으면 플런저가 다른 위치에 있으며 단일 다중 채널 주사기 펌프에 모두 잘 맞지 않습니다.
  3. 멸균 조건에서 수컷-바브 Luer 커넥터를 다운스트림 튜브의 한쪽 끝에 삽입하고 암 Luer 캡으로 캡핑합니다.
  4. 준비된 모든 튜브, 주사기 및 웰 플레이트를 관류에 사용할 인큐베이터로 조심스럽게 가져 오십시오.
  5. 주사기 펌프와 분획 수집기를 인큐베이터 근처의 원하는 위치에 놓습니다. 주사기 펌프를 인큐베이터 위 또는 근처에 놓고 분획 수집기를 포트 근처의 인큐베이터 옆에 놓습니다.
  6. 모든 상류 및 하류 튜브의 뚜껑이 덮인 끝을 함께 묶어서 인큐베이터 외부에서 포트를 통해 내부로 밀어 넣으십시오.
  7. 주사기를 주사기 펌프에 적재하고 다운스트림 튜브의 열린 끝을 분획 콜렉터의 다중 헤드 디스펜서의 분배 피펫 팁에 삽입합니다.
  8. 인큐베이터 내부에서는 가능한 한 많은 상류 튜브를 인큐베이터로 끌어 들여 흐르는 매체가 인큐베이터 공기로부터 열과 CO2를 수신 할 수있는 튜브의 길이를 최대화하십시오. 이들을 제자리에 고정시키면서 인큐베이터에서 하류 튜브를 당겨서 분수 수집기에서 가장 멀리 확장 된 지점에 도달 할 수 있도록 충분히 허용하면서 인큐베이터 내부의 뚜껑을 덮은 끝을 유지합니다.
  9. 각 플러그가 꽂힌 우물에 대해 바늘과 상류 및 하류 튜브의 뚜껑을 신속하게 풀고 Luer 커넥터와 함께 부착하십시오.
  10. 모든 부품이 연결되면 주사기 펌프를 비교적 빠른 속도로 간단히 실행하여 모든 스트림이 제대로 흐르고 있는지 확인하십시오.
  11. 이 시점에서, 매체로 가득 찬 하류 튜브로 실험을 시작하려는 경우, 모두가 채워질 때까지 펌프를 계속 가동하십시오. 그렇지 않으면 펌프를 중지하십시오.
  12. 주사기 펌프 유량과 분획 수집 빈도를 설정하고 두 기계를 동시에 시작하여 실험을 시작하십시오. 원하는 실험 기간 동안 분수를 수집합니다.

5. 여러 매체 소스에 대한 스톱콕으로 관류 시스템 설정

  1. 위의 4.1 단계의 모든 하위 단계를 수행하십시오.
  2. 관류에 사용할 두 개의 배지를 준비하여 먼저 분배 될 배지를 1로, 다른 배지를 배지 2로 표시하십시오.
  3. 각 배양물이 관류될 수 있도록, 하나의 주사기를 그 분배 기간 동안 충분한 배지 1로 채우고, 관류 시스템을 초기에 채우기에 충분한 부피를 더한다. 두 번째 주사기를 경륜의 시대 기간 동안 충분한 매체 2로 채 웁니다.
  4. 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결하십시오.
    참고: 주사기를 스톱콕에 연결하기 위한 튜브 길이가 필요할 수 있습니다.
  5. 스톱콕을 중간 1로 닫고 매체 2를 스톱콕에 분배하여 위의 단계 3.1.7-3.1.8과 유사한 방식으로 스톱콕 및 주사기를 준비하여 열린 포트에서 물방울을 떨어 뜨리기 시작할 때까지 스톱콕에 넣습니다.
  6. 스톱콕을 매체 2로 닫고 모든 잔류 매체 2가 개방 포트에서 플러시될 때까지 매체 1을 스톱콕에 분배한다.
  7. 암-바브 Luer 커넥터를 사용하여 업스트림 튜브를 개방형 스톱콕 포트에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 수컷-바브 Luer 커넥터를 삽입합니다.
  8. 상류 튜브가 완전히 배지로 채워질 때까지 주사기로부터 배지 1을 분배한다.
  9. 위의 4.3-4.11 단계를 진행하여 두 주사기를 별도의 주사기 펌프에 넣고 분배 매체 1 만 로딩하십시오.
  10. 매체 1에 대한 주사기 펌프 유량과 분획 수집 빈도를 설정하고 두 기계를 동시에 시작하여 실험을 시작하십시오.
  11. 배지 공급원이 변경될 때, 배지 1에 대한 시린지 펌프를 신속하게 정지시키고, 스톱콕을 매체 1로 닫고, 배지 2에 대한 시린지 펌프를 시작한다. 나중에 원하는 경우 비슷한 방식으로 소스를 다시 매체 1로 전환하십시오.
  12. 원하는 실험 기간 동안 분수를 수집합니다.

6. 약동학을 모방하기 위해 교반 탱크로 관류 시스템을 설정하십시오.

  1. 관심있는 약물에 대한 약동학 데이터를 얻고 그것이 농도 피크 다음에 지수 붕괴로 구성되는지 확인하십시오.
  2. 피크를 시간 0으로 설정하고 피크 이전의 데이터 포인트를 제거한 후 Stirred_Tank_Fit.m 스크립트(보충 파일 6)를 사용하여 교반된 탱크 RTD 방정식을 데이터에 맞춥니다. 입력 v(원하는 관류 유량) 및 시간 값 및 농도 값에 대한 t 및 C와 함께 스크립트에 직접 벡터 쌍으로 적합할 데이터를 입력합니다. 스크립트를 실행하여 필요한 교반 탱크 볼륨인 파라미터 V를 인쇄합니다.
  3. 관류 시스템에 두 개의 주사기 펌프와 인큐베이터 상류의 플레이트 셰이커를 포함하도록 레이아웃을 계획하십시오.
  4. 스톱콕 너머의 관류 시스템 구성 요소의 RTD를 측정하고 다양한 약물 펄스 지속 시간 및 농도로 RTD의 신호 컨볼루션을 수행하여 적절한 약동학 프로파일을 찾습니다. 이 계산에서 적합 교반 탱크 RTD 방정식을 사용하십시오.
  5. 위의 5.1-5.8단계를 진행합니다.
  6. 설치를 위해 교반 탱크로서 적절한 크기의 추가 웰 플레이트를 사용하십시오. 각각의 웰은 하나의 관류 배양을 위한 교반 탱크로서 작용할 수 있다. 필요한 양의 매체, V로 우물을 채우고 바늘을 처음에 끌어 올린 다음 우물 바닥으로 밀어 넣고 바늘을 뚜껑을 덮습니다.
  7. 주사기를 주사기 펌프에 넣고 주사기의 튜브를 교반 탱크의 캡핑 된 입구 바늘에 신속하게 연결하십시오. 그런 다음 세포 배양 상류 튜브 입구를 교반 탱크의 출구 바늘에 연결한다.
  8. 5.9-5.10단계를 진행합니다.
  9. 원하는 시간에, 단계 5.11에 기재된 바와 같이, 약물을 함유하는 분배 매질 2로 전환한다. 약물 주입이 완료되면 매체 1로 다시 전환하십시오.
  10. 5.12단계로 진행하십시오.

figure-protocol-1
그림 3: 다중 헤드 디스펜서. 레이저 컷 멀티 헤드 디스펜서를 위한 디자인. 이 수치는 Erickson et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

상기 프로토콜의 섹션 5로부터의 다중 배지 공급원을 갖는 관류 시스템은 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포에서 활성화된 B 세포 (NF-κB) 전사 인자의 핵 인자 카파-경쇄 인핸서에 의해 구동되는 리포터 유전자의 발현 동역학을 측정하기 위해 사용되었고, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 1.5 h 펄스에 반응하였다. HEK293 세포는 가우시아 루시퍼라아제 (GLuc)를 함유하는 유전자 작제물을 갖는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 안정적으로 형질도입되었고, NF-κB 반응 요소를 함유하는 NFKB라는 프로모터에 의해 구동되어 NFKB-GLuc HEK293 세포를 생성하고, 형질도입된 세포를 분리하기 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 통해 분류하였다. 분류된 세포는 사용 전까지 동결보존하였다.

각 관류 배양에 대해, 관류 셋업에는 세포를 포함하는 플러그형 48웰 플레이트로 이어지는 1m의 튜빙의 상류 섹션이 포함되었고, 이어서 0.5 mL/h(...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 작업은 TNF-α의 일시적인 펄스에 반응하여 NF-κB 구동 유전자 발현의 역학이 측정되는 구체적인 예와 함께 입증된 다수의 배지 공급원을 갖는 관류 세포 배양 시스템의 조립 및 작동을 기술한다. 관류 시스템 성분의 RTD를 측정하고 모델링하고, 신호 컨볼루션을 사용하여 수집된 유출수 배지 분획에서의 TNF-α 펄스에 대한 세포의 노출과 TNF-α 분포를 모두 예측하였다. 세포를 펄스에 노출시키고, 분획을 40시간 동안 수집하였고, 그 후 GLuc를 분획에서 측정하고, 자극-반응 동α동성을 밝히기 위해 예측된 TNF- 신호와 함께 플롯팅하였다.

이 관류 방법은 단점이없는 것은 아닙니다. 특히, 시스템은 인큐베이터 내에 설치된 후 튜브가 웰 플레이트에 연결되는 중요한 간단한 단계로 인해 멸균 위험을 수반합니다. 저자의 경험에서 오염은 매우 드뭅니다. 그럼에도 불구하고 오염 위험은 다음과 같은 방법으로 완화 될 수 있습니다. 첫 번째는 생물 안전 캐비닛에서 모든 세포 처리 절차 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 그랜트 번호 (Grant Nos)의 지원을 받아 수행되었습니다. 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 R01EB012521, R01EB028782 및 T32 GM008339.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
18 게이지 1 1/2 인치 주사기 및 디스펜싱 기계용 일회용 프로브 바늘Grainger5FVK2
293T 셀ATCCCRL-3216HEK 293T 셀은 대표 결과 실험에 사용됩니다.
96-Well Clear Bottom Plates, CorningVWR89091-010Plates는 RTD 실험에서 염료 농도를 측정하기 위한 것이고 대표적인 결과 실험에서 GLuc을 위한 것입니다.
BD  Luer-Lok 팁이 있는 일회용 주사기, 5 mLFisher Scientific14-829-45
BioFrac 분획 수집기 Bio-Rad7410002단일 스트림에 사용하거나 여러 스트림에서 수집할 수 있도록 당사의 방법을 사용하여 수정할 수 있는 분획 수집기입니다.
투명 고강도 자외선 저항성 아크릴 12" x 12" x 1/8"McMaster-Carr4615T93이 시트는 보조 자료의 DXF 파일에 따라 레이저 커터를 사용하여 절단하여 BioFrac 분획 수집기에 부착할 수 있는 다중 헤드 디스펜서를 생성합니다.
대표적인 결과에서 Gaussia luciferase bioluminescence assay에 사용된Coelenterazine nativeNanoLight Technology303
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, 크기 48  웰, 폴리스티렌 플레이트, 평평한 바닥 웰Millipore SigmaCLS3548대표적인 결과에서 293T 세포를 성장시키고 관류하는 데 사용됩니다.
코닝  Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, 크기 12Fisher Scientific720081관류 시 약동학 프로파일을 생성하기 위해 플러그를 꽂고 교반 탱크로 사용할 수 있습니다. 관류를 위해 세포를 포함할 수도 있습니다.
DMEM, 고포도ThermoFisher Scientific11965126
Epilog Zing 24 레이저커팅 엣지 시스템Epilog Zing 24아크릴 시트에서 멀티 헤드 디스펜서를 생산하는 데 사용되는 레이저 커터. 다른 레이저 절단기가 사용될 수 있습니다.
Fisherbrand 일회용 멸균 주사기, Luer-Lock, 20mLFisher Scientific14-955-460
Fisherbrand 일회용 멸균 주사기, Luer-Lock, 60mLFisher Scientific14-955-461
Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mLFisher Scientific05-408-129분획 수집용 마이크로 원심분리기 튜브.
피셔브랜드  일반 끝이 있는 둥근 바닥 일회용 붕규산 유리관Fisher Scientific14-961-26분획 수집용 유리관.
피셔브랜드  SureOne 마이크로포인트 피펫 팁, 범용 핏, 비필터Fisher Scientific2707410디스펜싱 팁 역할을 하는 멀티 헤드 디스펜서 및 튜빙에 가장 잘 맞는 300ul 피펫 팁.
기코  DPBS, 분말, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Fisher Scientific21600010인산염 완충 식염수.
Labline 4625 Titer ShakerMarshall ScientificLabline 4625 Titer Shaker교반 탱크를 혼합 상태로 유지하는 데 사용되는 궤도 셰이커.
Masterflex 피팅, 폴리카보네이트, 4방향 스톱콕, 수 루어 잠금, 비멸균; 10/PKCole-ParmerEW-30600-04RTD 실험 및 세포 배양 실험을 위해 여러 입구 스트림을 결합하는 데 사용됩니다.
Masterflex 피팅, 폴리카보네이트, 스트레이트, 여성 루어 x 캡; 25/PKMasterflexUX-45501-28
Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 스트레이트, 암 루어-호스바브 어댑터, 1/16"Cole-ParmerEW-45508-00
Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 스트레이트, 남성 루어 잠금 장치에서 호스바브 어댑터, 1/16" IDCole-ParmerEW-45518-00
Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 스트레이트, 플러그 어댑터에 대한 수 루어 잠금; 25/PKMasterflexEW-30800-30
Masterflex L/S 정밀 펌프 튜빙, 백금 경화 실리콘, L/S 14; 25피트MasterflexEW-96410-14
MATLABMathWorksR2019b버전 R2019b. 최신 버전도 사용할 수 있습니다. 일부 이전 버전이 작동할 수 있습니다.
NE-1600 6채널 프로그래밍 가능한 주사기 펌프New Era 펌프 시스템NE-1600
랙 세트 F1Bio-Rad7410010랙은 분획 수집기에 수집 튜브를 고정합니다.
재조합 인간 TNF-알파(HEK293 발현) 단백질, CFBio-Techne10291-TA-020사이토카인은 293T 세포를 자극하는 데 사용되었습니다.
Saint Gobain 솔리드 스토퍼, Versilic 실리콘, 크기: 00, 바닥 10.5mmSaint GobainDX263015-5048-well 플레이트에 맞습니다.
Saint Gobain 솔리드 스토퍼, Versilic 실리콘, 크기: 4 바닥 21mmSaint GobainDX263027-1012-웰 플레이트에 맞습니다.
수산화 나트륨, 10.0 N 수용액 APHA; 1 LSpectrum ChemicalsS-395-1LT
SolidWorksDassault Systems멀티헤드 디스펜서 DXF 파일을 만드는 데 사용되는 SolidWorks CAD 소프트웨어.
Varioskan LUX 멀티모드 마이크로플레이트 리더ThermoFisher ScientificVL0000D0플레이트 리더.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, BlueMichaels10404779RTD 실험에서 추적자로 사용되는 Brilliant Blue FCF를 함유한 Blue 식품 염료. 흡광도 스펙트럼은 628nm에서 최고조에 달합니다.
기판.웰 당

참고문헌

  1. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  2. Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).
  3. Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).
  4. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
  5. Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
  6. Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
  7. Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).
  8. Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
  9. Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
  10. Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
  11. Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).
  12. Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
  13. Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
  14. Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
  15. Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615(2019).
  16. Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
  17. Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
  18. Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
  19. Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
  20. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
  21. Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

동적 세포 배양을 위한 출구 분별과 통합된 다중 스트림 관류 생물반응기
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.