이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
중강경에서 뇌 조직의 현미경 수준에 이르기까지 신경 구조를 시각화하기 위해 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 신경 회로에서 세포 하부 신경 구조에 이르기까지 뉴런 구조는 ScaleSF로 광학적으로 클리어 된 마우스 뇌 조각에서 시각화됩니다. 이 클리어링 방법은 ScaleS의 변형 된 버전이며 강력한 클리어링 기능뿐만 아니라 형광 신호의 높은 수준의 보존 및 구조적 무결성을 달성하는 조직 슬라이스에 대한 친수성 조직 제거 방법입니다. 사용자 정의 가능한 3차원(3D) 인쇄 이미징 챔버는 클리어된 뇌 조직의 안정적인 장착을 위해 설계되었습니다. 강화된 녹색 형광 단백질 유전자를 운반하는 아데노 관련 바이러스 벡터를 주입한 마우스 뇌를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 진동 조직 슬라이서로 1-mm 두께의 조각으로 절단하였다. 뇌 조각은 세 가지 용액, 즉 Sca l eS0 용액, 인산염 완충 식염수 (-) 및 ScaleS4 용액에서 순차적 인 배양을 포함하는 클리어링 프로토콜에 따라 총10.5-14.5 h의 클리어링 프로토콜에 따라 제거되었습니다. 클리어된 뇌 조각을 이미징 챔버에 장착하고 ScaleS4D25(0) 용액에 용해된 1.5% 아가로스 겔에 매립하였다. 슬라이스의 3D 이미지 획득은 긴 작동 거리의 다중 침지 대물 렌즈가 장착 된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 중강경 신경 영상으로 시작하여, 우리는 수지상 척추 및 축삭돌과 같은 미세한 세포 하부 신경 구조를 광학적으로 지워진 뇌 조각에서 시각화하는 데 성공했습니다. 이 프로토콜은 회로에서 아세포 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조의 이해를 용이하게합니다.
서론
조직 제거 방법은 광 현미경으로 생물학적 및 임상 샘플의 깊이 독립적 인 이미징을 개선하여 손상되지 않은 조직 1,2에 대한 구조 정보를 추출 할 수 있습니다. 광학 클리어링 기술은 잠재적으로 속도를 높이고 조직학적 분석 비용을 절감할 수 있습니다. 현재 세 가지 주요 클리어링 접근법이 있습니다 : 친수성, 소수성 및 하이드로 겔 기반 방법 1,2. 친수성 접근법은 형광 신호 및 조직 완전성을 보존하는 데 있어 능가하며, 다른 두 접근법(3,4)에 비해 독성이 적다.
친수성 클리어링 방법인 ScaleS는 구조적 및 분자 무결성의 보존과 강력한 클리어링 능력(클리어링-보존 스펙트럼)5으로 독특한 위치를 차지하고 있습니다. 이전 연구에서, 우리는 Sca l eS6의 클리어링 절차를 수정하여 조직 슬라이스 (~ 1-mm 두께)에 대한 신....
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프로토콜
모든 실험은 준텐도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 2021245, 2021246)의 승인을 받았으며 일본 과학위원회 (2006)의 동물 실험의 적절한 수행을위한 기본 지침에 따라 수행되었습니다. 여기서, 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 유전자와 파브알부민(PV)/미리스토일화-EGFP-저밀도 지단백 수용체 C-말단 박테리아 인공염색체(BAC) 형질전환 마우스(PV-FGL 마우스)9 를 담은 AAV 벡터를 주입한 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. PV-FGL 마우스는 C57BL/6J 배경에서 유지되었다. 이 연구와 관련하여 성별에 근거한 차이는 발견되지 않았습니다.
1. 조직 준비
- 관류 고정
참고: 흄 후드에서 1.1.1~1.1.3단계를 수행하여 파라포름알데히드(PFA)에 대한 노출을 제한하십시오.- 성인 남성 마우스 (8-16 주령)를 펜토바르비탈 나트륨 (200 mg / kg)의 과다 복용으로 복강 내 주사하여 마취하십시오. 발가락 꼬집음 금단과 눈 깜빡임 반사의 부재로 마취의 적절성을 확인하십시오.
- 흉강을 열고 수술 가위로 오른쪽 심방 부속기를 자릅니다. 20 mL 주사기에 부착된 ....
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결과
1-mm 두께의 마우스 뇌 슬라이스의 광학 클리어링은 이 프로토콜을 사용하여 달성되었다. 도 1B 는 클리어링 처리 전후의 마우스 뇌 슬라이스의 전송 이미지를 나타낸다. 조직 제거 방법은 1mm 두께의 마우스 뇌 조각을 투명하게 렌더링했습니다. 뇌 조각의 최종 크기에서 약간의 확장은 12 h 동안 클리어링 용액에서 인큐베이션 한 후에 발견되었다 (선형 팽창 : 102.5 % ± 1.3 %). 조직의 형광 및 구조적 완전성의 보존을 PV-FGL 마우스에서 원형질막에서의 표적화된 EGFP 발현으로 평가하였다(도 1C). 이들 마우스에서, 소마토덴드린성 막-표적화된 EGFP는 PV 양성 뉴런9에서 발현된다. 소마토덴드리아 영역에서 원형질막을 표적으로 하는 EGFP 발현은 처리 후에 유지되었다(도 1C). 또한, 이전의 EM 연구는 Scale.......
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토론
프로토콜 내의 중요한 단계
프로토콜에는 의미 있는 결과를 얻기 위해 최대한의 주의를 기울여 수행해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 샘플의 균일 한 고정은 대규모 조직 내에서 3D 이미징을 위해 필수적입니다. 대물 렌즈, 샘플 및 침지 유체는 일치하는 RI를 가져야합니다. 이들 사이의 RI-불일치는 제거된 뇌 절편 내에서 EGFP 발현 세포의 고도로 교란된 영상화로 이어질 것이다(도 3). 대물 렌즈를 침지 유체에 대한 보정 칼라 조정은 깊이 유도 구형 수차를 최소화하여 3D 이미징에서 신호, 콘트라스트 및 공간 분해능을 극대화합니다. 준비된 용액의 RI는 굴절계를 사용하여 측정 할 수 있습니다.
기술 문제 해결
용액의 더 긴 저장은 클리어링 능력과 형광 신호 보존 능력 및 구조적 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. 갓 준비된 용액을 사용해야합니다. 이들 용액은 4°C에서 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은 AAV 벡터 제작을 위한 이시다 요코(준텐도 대학)와 기술 지원을 위해 호시노 키사라(준텐도 대학)에게 감사를 표한다. 본 연구는 JSPS KAKENHI (JP20K07231 내지 K.Y.; JP21H03529 내지 T.F.; JP20K07743 내지 M.K.; JP21H02592 내지 H.H.) 혁신 영역 "공명 바이오"에 대한 과학 연구 (JP18H04743 ~ H.H.). 이 연구는 또한 일본 의학 연구 개발청 (AMED) (JP21dm0207112 ~ T.F. 및 H.H.), 일본 과학 기술국 (JST)의 Moonshot R & D (JPMJMS2024 ~ H.H.), JST (JPMJFR204D에서 H.H.까지)의 파괴적인 과학 기술을위한 융합 지향 연구 (FOREST), 중텐도 대학 의과 대학 의과 대학 노년기 질환 연구소 (X2016 ~ K.Y.; X2001 to H.H.), 그리고 사립 학교 브랜딩 프로젝트.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 16x 다중 침수 대물 렌즈 | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ- 사이클로덱스트린 | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| 메틸-&베타;-사이클로덱스트린 | 도쿄 화학 산업 | M1356 | |
| 파라포름알데히드 | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| 인산염 완충 식염수(10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| 진동 조직 슬라이서 | Dosaka EM | PRO7N |
참고문헌
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R.
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재인쇄 및 허가
