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방법 논문

간세포 암종의 동소 마우스 모델에서 비침습적 PET/MR 이미징

2.4K 조회수

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DOI:

10.3791/63958

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2022년 8월 31일

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1Department of Diagnostic Radiology, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Department of Oncology, MRC Oxford Institute for Radiation Oncology, University of Oxford, 3Department of Surgery, School of Clinical Medicine, HKU-SZH & LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 4Department of Biomedical Engineering, The Chinese University of Hong Kong, 5Department of Diagnostic and Interventional Radiology, Kwong Wah Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 간동맥 결찰을 포함하거나 포함하지 않는 동소 간세포 암종 이종이식편을 만들고 [18 F]플루오로미소니다졸([18 F]FMISO) 및 [18F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG).

초록

인간 질병을 요약하는 간세포 암종(HCC)의 전임상 실험 모델은 종양 형성을 연구하고 새로운 치료 접근법을 평가하는 중요한 도구입니다. 양전자 방출 단층 촬영(PET)을 사용한 비침습적 전신 영상은 분자 수준에서 조직의 생체 내 특성에 대한 중요한 통찰력을 실시간으로 제공합니다. 우리는 여기에서 종양 저산소증을 유도하기 위한 간동맥 결찰술(HAL)을 동반하거나 동반하지 않는 동소 간세포암종 이종이식 생성을 위한 프로토콜과 [18 F]플루오로미소니다졸([18 F]FMISO) 및 [18 F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG) PET/자기 공명(MR) 영상. 종양 저산소증은 저산소증 마커 [18F]FMISO를 사용하여 쉽게 시각화할 수 있었고, [18F]FMISO 흡수는 HAL을 받은 HCC 마우스에서 비 HAL 그룹보다 더 높았지만 [18F]FDG는 두 그룹 간의 종양 저산소증을 구별할 수 없었습니다. HAL 종양은 또한 저산소증에 대한 반응으로 더 높은 수준의 저산소증 유도 인자 (HIF)-1α 발현을 나타냈다. HAL 종양의 정량화는 표준화된 값 흡수(SUV) 접근법에 기초하여 [18F]FMISO 흡수의 2.3배 증가를 보여주었다.

서론

간세포 암종(HCC)은 전 세계적으로 6번째로 많이 진단된 암이자 3번째로 흔한 암 사망 원인으로, 2020년에 900,000명 이상의 새로운 사례와 800,000명 이상의 사망자가 발생했습니다1. 주요 위험 인자는 바이러스 감염(B형 및 C형 간염 바이러스), 알코올 남용, 당뇨병 및 비알코올성 지방간염2의 결과로 발생하는 간경변입니다. 간세포암종의 관리는 다소 복잡하며, 병기 병기에 따라 외과적 절제술, 열적 또는 화학적 절제술, 이식, 경동맥 화학색전술, 방사선 및 화학요법을 포함한 여러 치료 옵션을 이용할 수 있다 2,3. 간세포암종은 화학요법 불응성 종양으로, 치료 요법 후 환자의 최대 70%에서 질병이 재발한다2.

높은 수준의 종양 이질성에도 불구하고, 간세포암종은 두 가지 일반적인 결과와 관련이 있다: (i) 간세포암은 매우 저산소성이고, (ii) 종양 저산소증은 더 큰 종양 공격성 및 치료 실패와 관련이 있다. HCC 세포의 통제되지 않은 증식은 혈관 형성에 앞서 높은 산소 소비율을 초래하여 저산소 미세 환경을 만듭니다. 낮은 종양 내 산소 수치는 종양 공격성 및 치료 반응에 영향을 미치는 다양한 생물학적 반응을 유발합니다. 저산소증 유발 인자(HIF)는 종종 저산소증에 대한 반응에서 필수 전사 조절자로 인식됩니다 2,3. 따라서 저산소증을 감지하는 능력은 종양 조직을 시각화하고 침습적 절차가 필요한 접근하기 어려운 부위를 식별하는 데 중요합니다. 또한 종양 공격성으로 이어지는 분자 변화를 더 잘 이해하고 환자 치료 결과를 개선하는 데 도움이 됩니다.

양전자 방출 단층 촬영(PET)을 사용한 분자 영상은 HCC를 포함한 많은 암의 진단 및 병기 결정에 일반적으로 사용됩니다. 특히, [18F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG)와 [11C]아세테이트를 포함하는 이중 추적자 PET 이미징을 함께 사용하면 HCC 진단에서 전반적인 민감도를 크게 높일 수 있습니다 4,5. 반면에 저산소증의 영상은 일반적으로 사용되는 저산소 마커 [18F]플루오로미소니다졸([18F]FMISO)을 사용하여 달성할 수 있습니다. 임상적 실습에서 저산소증의 비침습적 평가는 방사선 치료 계획을 위해 다양한 유형의 종양과 부위를 구별하는 데 중요하다6.

전임상 영상은 다양한 질병에 대한 마우스 모델의 비침습적 및 종단적 평가에 없어서는 안될 도구가 되었습니다. 강력하고 재현성이 높은 HCC 모델은 인간 HCC의 병태생리학 및 새로운 치료법 평가에 대한 전임상 및 중개 연구를 위한 중요한 플랫폼을 나타냅니다. PET 이미징과 함께 생체 내 행동을 설명하여 주어진 시점에 대한 분자 수준에서 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 우리는 [18F]FMISO 및 [18F]FDG PET/MR을 사용하여 간동맥 결찰(HAL) 동소 HCC 이종이식편 생성 및 생체 내 종양 대사 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. HAL의 혼입은 생체 내에서 종양 저산소증을 유도하기 위해 동맥혈 공급을 효과적으로 차단할 수 있기 때문에, 생체 내에서 종양 저산소증을 연구하기 위해 형질전환 또는 화학적으로 유도된 HCC 마우스 이종이식편의 적합한 모델을 만든다 7,8. 또한, 피모니다졸을 사용한 생체 외 면역조직화학 염색과 달리, 저산소증으로 인한 종양 대사의 변화를 쉽게 시각화하고 PET 이미징을 사용하여 비침습적으로 정확하게 정량화할 수 있어 치료 반응의 종단적 평가 또는 내성 출현 측정이 가능합니다 3,7,8 . 여기에 표시된 우리의 방법을 사용하면 생체 내에서 HCC 생물학을 연구하기 위해 PET/MR 이미징을 사용하여 종양 저산소증의 비침습적 모니터링과 함께 강력한 저산소 HCC 모델을 만들 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 AAALAC(Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)의 인증을 받은 프로그램인 홍콩 대학교 비교 의학 연구 센터(CCMR)의 교육 및 연구에서 살아있는 동물 사용 위원회(CULATR)에 따라 수행되었습니다. 연구에 사용된 동물은 6-8주령의 암컷 BALB/cAnN-nu(누드) 마우스였으며 체중은 20g ± 2g이었습니다. 음식과 물은 임의로 제공되었습니다.

1. 인간 간세포 암종 세포주의 피하 주사

참고: MHCC97은 피하 HCC 이종이식 모델을 생성하는 데 사용되는 인간 HCC 세포주입니다. MHCC97L 세포는 중화인민공화국상하이 에 있는 푸단대학교 중산병원의 간암연구소로부터 입수하고9 단일연속반복(STR) 프로파일링에 의해 인증한다.

  1. MHCC97L 세포를 배양하고 5%CO2 가 공급된 가습 배양기에서 T-75 세포 배양 플라스크에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 배양 배지에서 유지한다( 재료 표 참조). 2일마다 배양 배지를 교체하고 80%-90% 밀도로 세포를 수확합니다.
    참고: 시작 셀 번호는 1.5 x 10 6 셀이며 셀은6-8 통로 내에서 사용됩니다.
  2. 배양액을 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(trypsin-EDTA)을 사용할 때까지 암실에서 4°C에서 보관한다. 배양 배지를 37°C로 예비하고 트립신 EDTA를 사용 전에 실온으로 예열한다. 이 섹션에 사용된 모든 시약 및 소모품에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
  3. 배양 배지를 제거합니다. 10mL의 멸균 인산염 완충 식염수(DPBS, 재료 표 참조)로 세포층을 헹굽니다.
  4. 배양 플라스크에 5 mL의 트립신-EDTA를 넣고 37°C에서 세포를 배양한다. 세포층이 분산되어 플라스크에서 완전히 분리될 때까지 20x 배율( 재료 표 참조)로 도립 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포가 트립신-EDTA에 15분 이상 남아 있지 않은지 확인하십시오.
  5. 배양 플라스크에 배양 배지 5mL를 추가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 세포를 흡인합니다. 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 1,107 x g 에서 5분 동안 회전합니다( 재료 표 참조).
  6. 상층액을 제거하고 PBS 1mL로 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 단세포 현탁액을 얻기 위해 철저하게 피펫팅한다. 자동 세포 계수기( 재료 표 참조)를 사용하여 세포 수를 결정하고 PBS에서 5 x 106 cells/mL 농도로 세포 현탁액을 준비합니다.
  7. 1mL 주사기에 25G 바늘로 200μL의 세포 현탁액을 채취합니다. 각 주사기에는 1 x 106 MHCC97L 세포(200μL)가 들어 있습니다. 주사기를 젖은 얼음 위에 보관하십시오.
  8. 케타민(87.5mg/kg)과 자일라진(12.5mg/kg)의 혼합물을 복강내(ip) 주사하여 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사를 사용하여 적절한 마취를 확인하십시오. 건조와 각막 궤양의 잠재적인 형성을 방지하기 위해 마우스에 눈 윤활제를 바르십시오. 마우스를 멸균 패드의 앙와위 자세로 놓습니다( 재료 표 참조).
  9. 마우스의 아래쪽 옆구리(왼쪽 또는 오른쪽) 근처의 등쪽 부위를 70% 에탄올로 소독합니다( 재료 표 참조). 집게로 피부를 들어 올리고 바늘 경사를 피부 아래에 부드럽게 삽입합니다.
  10. 바늘을 빼낼 때 주사 부위에서 세포 현탁액이 우발적으로 누출되는 것을 방지하기 위해 천자 부위에서 피하 평면을 따라 바늘을 4-5mm 전진시킵니다. 바늘 삽입이 우발적인 장기 손상을 일으킬 수 있는 피부 아래 너무 깊숙이 있지 않은지 확인하십시오.
  11. 집게를 풀고 반대쪽을 관통하지 않도록주의하면서 주사기의 내용물을 조심스럽게 천천히 배출하십시오. 주사 부위가 부풀어 오르는지 확인하기 위해 바늘을 빼냅니다. 마우스를 미리 예열된 가열 패드 위에 있는 케이지에 다시 넣어 마취 회복을 돕고 이동성을 회복합니다. 마우스가 완전히 깨어나고 흉골 누운 자세를 유지할 때까지 마우스를 계속 모니터링합니다.
  12. 매주 마우스의 종양 성장과 웰빙을 모니터링합니다. 캘리퍼를 사용하여 종양 부피(V)를 측정합니다( 재료 표 참조). 하기 식10을 사용하여 종양 부피를 계산하고 기록한다.
    V = (여 2× L)/2
    여기서 W는 너비이고 L은 종양의 길이입니다.
  13. 주사 후 4-6주 사이에 800-1000mm3 사이의 상당한 크기의 피하 종양이 얻어지는지 확인합니다. 총 종양 부하가 체중의 10 %를 초과하지 않도록하십시오.

2. 동소 간 이식 및 간동맥 결찰술

  1. 소독된 생물학적 안전 캐비닛에 다음 수술용 시약 및 도구를 준비합니다: 접시에 배양액 10mL, 10% 포비돈 요오드 용액, 70% 에탄올, 고압 멸균 수술 도구(예: 날카로운 가위, 스프링 가위, 집게(곡선 미세 및 직선 둔기), 바늘 홀더, 메스 블레이드, 6-0 및 5-0 나일론 봉합사, 가열 패드.
  2. 모든 수술 기구를 오토클레이브하고 멸균 벤치에서만 취급하십시오. 수술 절차 전반에 걸쳐 생쥐에게 적절하고 필요한 수술 전, 수술 중 및 수술 후 관리를 제공합니다(아래 단계 참조).
    1. 수술 전 통증 완화를 위해 수술 시작 최소 30분 전에 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 피하 주사합니다. 수술 후 관리 및 관리를 위해 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 8-12시간마다 한 번씩 3일 동안 지속적으로 피하 주사합니다. 이 섹션에 사용된 모든 시약 및 소모품에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
  3. 피하 종양이 있는 마우스를 i.p. 펜토바르비탈(330mg/kg) 주사. 메스 칼날을 사용하여 종양 부위의 피부를 절개하십시오. 피하 종양 블록을 절제하고 즉시 배양 배지로 옮깁니다. 가능한 한 빨리 이 단계를 수행합니다.
  4. 날카로운 수술용 가위를 사용하여 종양 블록을 1mm3 개의 작은 종양 큐브로 자릅니다. 모든 종양 큐브를 배양 배지에 보관하십시오. 피하 종양 블록의 핵심 영역을 사용하지 마십시오.
  5. 케타민(87.5mg/kg)과 자일라진(12.5mg/kg)의 혼합물을 i.p. 주사하여 후속 동소 종양 이식 수술을 받을 마우스를 마취합니다. 마우스를 마취하기 전에 부프레노르핀을 투여한 후 최소 30분이 경과했는지 확인하십시오. 건조와 각막 궤양의 잠재적인 형성을 피하기 위해 마우스에 눈 윤활제를 바르십시오.
  6. 예열된 가열 패드 위에 있는 멸균 패드에 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다. 수술 절차가 끝날 때까지 15분마다 마우스의 생리적 상태를 모니터링하고 기록합니다.
  7. 마우스의 팔다리를 뻗습니다. 복부 복부와 흉부의 노출을 최대화하기 위해 테이프로 고정하십시오. 마우스의 복부 피부 전체를 10 % 포비돈 요오드 용액으로 소독 한 다음 70 % 에탄올로 소독하십시오. 발가락 꼬집기(페달 철회 반사)에 반응이 없는지 확인하여 마우스의 마취 깊이를 평가합니다.
  8. 날카로운 가위를 사용하여 복막에 접근하기 위해 약 10mm 정중선 절개를 하여 개복술을 시행합니다. 집게로 검상돌기를 머리 쪽으로 고정하고 당기고 늑골하 견인기를 적용하여 수술 부위를 엽니다. 수술 부위를 잘 외과적으로 볼 수 있도록 적절한 절개가 이루어졌는지 확인하십시오.
  9. 젖은 거즈 면봉으로 중앙값과 왼쪽 돌출부를 위쪽으로 집어넣습니다. 복부 바깥쪽의 내장을 마우스의 왼쪽으로 옮기고 젖은 거즈 면봉으로 덮으십시오. 최적화된 시각화를 위해 돋보기 아래에서 췌장 머리에서 시작하여 간경의 뿌리까지 총 간동맥(CHA)에 간동맥 결찰술(HAL)을 수행합니다.
  10. 젖은 거즈 면봉으로 중앙 및 왼쪽 로브를 앞/아래로 집어넣어 왼쪽 엽을 노출시킵니다. 멸균 메스 블레이드로 왼쪽 엽 표면에 길이와 깊이가 약 2mm인 절개를 합니다.
    참고: 종양 이식을 위해 간의 정중엽을 사용하여 인접한 복부 장기에 대한 외상으로 인한 우발적인 파열이나 열상을 최소화하는 것도 가능합니다.
  11. 멸균 된 집게로 간 절개 부위에 종양 조각을 즉시 삽입하십시오. 종양이 간에서 안전하게 앉을 수 있도록 묻어 두십시오. 절개 부위에 6-0 나일론 봉합사로 8자 봉합사를 적용하여 간과 지혈에 적절한 종양 조각 이식을 보장합니다. 과도한 출혈을 피하기 위해 가능한 한 빨리이 수술을 수행하십시오. 완료되면 중단 된 5-0 봉합사로 복부 절개를 닫습니다.
  12. 마우스를 미리 예열된 가열 패드 위에 있는 케이지에 다시 넣어 마취 회복을 돕고 교정 반사를 회복합니다. 마우스가 완전히 깨어나고 흉골 누운 자세를 유지할 때까지 15분마다 마우스의 생리적 상태를 계속 모니터링하고 기록합니다.
  13. 모든 마우스가 동소 종양 이식을 통과 할 때까지 절차를 반복하십시오. 수술 후 3일 동안 매일 생리적 상태를 지속적으로 모니터링하여 모든 마우스에게 수술 후 관리를 제공합니다. 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 8-12시간마다 투여합니다.

3. PET/MR 교정 및 워크플로우 설정

참고: 이미징은 전임상 PET/MR 3T 시스템을 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조).

  1. 5% 이소플루란(1L/min 의료용 O2)을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다. 각 스캔에 대해 마취된 마우스를 지속적으로 가열하여 이미징 베드에 조심스럽게 놓습니다. 먼저 정적 [18F]FMISO 또는 [18F]FDG PET 스캔에 대한 해부학적 참조로 MR(스카우트 보기)을 사용하여 스캔한 다음 해부학적 참조 MR 이미징을 수행합니다.
  2. 소프트웨어에서 순차적 PET/MR 이미징 워크플로우를 생성하여 정적 PET 스캔, T1 강조(감쇠 보정) 및 T2 강조(해부학적 참조) MR 이미징, 예정된 이미징 세션 1일 전에 PET 재구성을 포함합니다.
  3. PET를 획득하려면 400-600keV 수준 식별, F-18 연구 동위원소, 1-5 일치 모드 및 20분 스캔을 선택합니다.
  4. 전신 T1 강조 MR을 획득하려면 TE = 4.3ms, TR = 16ms, 시야(FOV) = 90mm x 60mm, 여기 수(NEX) = 3, 두께 0.9mm의 슬라이스 28개, 복셀 크기 = 0.375mm3 x 0.375mm 3 x 0.9mm3의 그래디언트 에코-3D를 사용합니다.
  5. 전신 T2 가중 MR을 획득하려면 TE = 71.8ms, TR = 3000ms, FOV = 90mm x 60mm, NEX = 5, 0.9mm 두께의 슬라이스 28개, 복셀 크기 = 0.265mm 3 x 0.268mm3 x 0.9mm3의 고속 스핀 에코 2D를 사용합니다.
  6. PET를 재구성하려면 Tera-Tomo(TT3D) 알고리즘, 반복 = 8, 부분 집합 = 6, 1-3 일치 모드를 선택하고 감쇠, 데드 타임, 랜덤, 감쇠 및 산란 보정을 사용하여 전체 복셀 크기가 0.3mm인 이미지를 만듭니다3.
  7. 실험 시작 전에 PET 활성 테스트를 수행하여 PET 정량정확도를 확인합니다 11.
    1. 제조업체의 권장 사항에 따라 물이나 식염수에 희석한 5-8MBq[18F]FMISO로 5mL 주사기를 채웁니다. 선량 교정기를 사용하여 주사기의 활동을 기록하십시오( 재료 표 참조). 측정 시간을 기록하십시오.
    2. 전체 주사기를 덮기 위해 재구성된 이미지에 관심 볼륨(VOI)을 그립니다. 이미지에서 회복된 활동을 선량 교정기에서 얻은 값과 비교합니다. 회복된 활동이 ±5% 이내일 때 이미징 연구를 진행합니다.

4. [18 F] FMISO와 [18F] FDG 주입

  1. 이미징 연구를 시작하기 30분 전에 공급자로부터 [18F]FMISO의 임상 용량을 얻습니다. 방사성 물질을 취급할 때는 실험복, 장갑, 오버 안경, 필름 배지 및 링 선량계와 같은 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 방사성 물질의 교차 오염을 피하기 위해 장갑을 자주 교체하십시오.
  2. 방사성 저장 용액을 L-블록 탁상용 실드 뒤에 있는 납 저장 용기에 넣습니다. [18F]FMISO의 분취량을 분배하고 멸균된 식염수로 희석합니다. 총 활성 농도가 100μL에서 18-20MBq인지 확인합니다.
  3. 바늘이 있는 18mL주사기로 [1F]FMISO를 그립니다( 재료 표 참조). 선량 교정기에 표시된 방사능과 시간을 기록하십시오.
  4. 방사성 추적자를 주입하기 전에 마우스 무게를 기록합니다. 5% 이소플루란(1L/min 의료용 O2)을 사용하여 마우스를 마취한 다음 준비된 [18F]FMISO를 꼬리 정맥을 통해 조심스럽게 주입합니다. 붕괴 보정을 설명하기 위해 주사기의 주입 시간과 잔류물 활성을 기록합니다. PET 스캔 전에 [180 F]FMISO 흡수를 허용하기 위해 마우스를 케이지에 18분 동안 다시 넣습니다. [1 F]FMISO PET 후 18일 동안 마우스가 회복되도록 합니다.
    참고: [18F]FMISO 및 [18F]FDG에 대한 생체 내 약동학 프로파일이 매우 다름에도 불구하고, 두 방사성 추적자는 반감기가 109.77분(< 2시간)인 PET 방사성 핵종인 F-18로 방사성 표지됩니다. PET 신호는 F-18에서 발생하기 때문에 초기 주입된 방사능의 절반은 2시간마다 손실됩니다. 이 경우 주입 후 24시간 후에 잔류 신호를 더 이상 PET 스캐너에서 감지할 수 없습니다. 또한, [18 F]FMISO(18 F]FDG(3 일) 주사 사이의 1일 간격은 [18 F]FDG PET가 수행될 때 [18 F]FMISO의 완전한 붕괴를 허용하므로 [18F]FDG PET 스캔에서 [18F]FMISO 신호가 겹치지 않습니다.
  5. 4.1.-4.4단계를 반복합니다. 3일째 [18F]FDG 주사의 경우, 100μL에서 6-8MBq의 총 활성 농도를 PET 스캔 시작 전 60분 흡수로 주입하는 것을 제외하고.
  6. 다음 수식18을 사용하여 주입된 [18F]FMISO 또는 [11F]FDG 활성을 계산합니다.
    주입 활성(MBq) = 주입 전 주사기의 활성 - 주입 후 주사기 내 활성

5. PET/MR 획득

  1. 예약된 PET 스캔 전에 공기 히터를 켜서 마우스 이미징 베드를 예열합니다. 5% 이소플루란(1L/min 의료용 O2)을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다.
  2. 적절하게 마취되고 발가락 꼬집음 반응을 사용하여 확인되면 조심스럽게 즉시 마우스를 가열 베드로 옮기고 마취를 2%-2.5% 이소플루란으로 유지합니다. 머리가 엎드린 마우스를 바이트 바에 놓고 건조함과 각막 궤양의 잠재적인 형성을 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 윤활제를 바릅니다. 이미징 베드를 플라스틱 시트로 덮어 베드 주변 온도를 유지합니다.
  3. 마우스의 호흡수와 체온을 각각 사내 호흡 패드와 열 프로브를 사용하여 모니터링하고 기록합니다. 이소플루란 수준을 조정하여 마우스의 체온이 37°C로 유지되고 호흡수가 분당 40-50회 호흡(bpm) 범위로 유지되는지 확인합니다.
  4. 스카우트 보기를 수행하여 스캐너 내부의 마우스 위치를 찾습니다. 몸통 영역이 MR의 중앙 FOV에 위치하도록 마우스 침대 위치를 조정하여 마우스 본체 전체를 덮습니다.
  5. PET 스캔을 시작하려면 스터디 목록 창에서 PET 획득을 선택한 다음 이전 획득 시 스캔 범위를 선택하여 스카우트 뷰에서 미리 결정된 마우스 베드 위치를 사용합니다. 준비(Prepare) > 확인(OK )을 클릭하여 마우스 베드를 MR에서 PET로 자동 이동하고 수집을 시작합니다.
  6. Radiopharmaceutical Editor에서 적절한 방사성 핵종을 선택한 다음 18 단계에서 측정 한 [18F] FMISO 또는 [4.3F] FDG 주입 전후의 주입 용량과 시간에 대한 세부 정보를 입력합니다. 및 4.4 단계. Subject Information 메뉴에서 마우스 무게를 입력합니다.
  7. PET 스캔이 완료되면 MR 획득을 진행합니다. 이렇게 하려면 준비를 선택하여 마우스를 PET에서 MR로 이동합니다. OK(확인 )를 클릭하여 계속합니다.
  8. 모든 스캔이 완료되면 홈 을 선택하여 이미징 베드를 기본 위치로 다시 이동합니다.
  9. 마취를 끄고 의료용 O2로 이미징 베드를 세척하십시오. 마우스 페달 인출 반사를 확인하십시오. 마취 회복을 돕고 교정 반사를 회복하기 위해 이미징 베드에서 가열 패드 위에 놓인 깨끗한 하우징 케이지로 마우스를 다시 옮깁니다.
  10. Raw Scan(원시 스캔)에서 PET Acquisition(PET 획득)을 선택하여 PET 재구성을 위해 수집된 원시 PET 데이터를 로드합니다. 재질 맵으로 사용할 MM을 선택합니다. 3.6단계에서 설명한 대로 매개변수를 사용하여 PET 재구성을 진행합니다.
  11. PET 이미징 연구 후 마우스를 취급할 때 지역 및 기관 지침을 엄격히 준수하십시오. 마우스와 직접 접촉한 모든 사용한 소모품(예: 주사기, 바늘, 장갑, 물티슈 및 생물학적 폐기물)(예: 케이지 침구 및 배설물)은 방사성 폐기물로 처리하고 현지 규정에 따라 주의해서 취급하십시오.

6. PET 이미지 분석

  1. 이미지 분석 소프트웨어(재료 표 참조)를 열고 DICOM 데이터 로드를 선택하여 PET 및 MR 이미지를 엽니다.
  2. 해당 PET 및 MR 이미지를 소프트웨어 디스플레이 창으로 드래그하고 자동 등록을 선택하여 결과 PET 및 MR 이미지의 자동 공동 등록을 수행합니다.
    1. Registration Setup(등록 설정) 메뉴에서 Rigid transformation(강체 변환)을 선택합니다. Shift 및 Rotation 메뉴의 Rigid/Affine 메뉴를 사용합니다.
    2. Global Role Selection(전역 역할 선택) 메뉴에서 MM을 Reference(참조)로, Static PET Scan(정적 PET 스캔)을 Reslice(리슬라이스)로 클릭합니다.
    3. 공동 등록된 PET/MR 이미지를 검사하여 적절한 정렬을 확인합니다. 필요한 경우 수동 등록을 사용하여 이미지를 수동으로 조정합니다.
    4. MR 이미지를 사용하여 간에서 동소 종양을 찾습니다. Interpolated Ellipse ROI 를 사용하여 참조용 MR 이미지를 사용하여 종양에 VOI를 그립니다. 생성된 종양 VOI를 MR에서 PET 이미지로 전송합니다. 브러시 도구 및 지우개 도구를 선택하여 슬라이드별로 VOI 테두리를 신중하게 정의합니다. PET 이미지에서 간에서 방사능 흡수가 유출되지 않도록 하십시오.
    5. 타원 VOI를 사용하여 참조 기관으로 간에 3mm3 VOI를 만듭니다. MR 이미지를 가이드로 사용하여 눈에 보이는 간혈관 및 담도 구조의 영역을 피하십시오.
    6. ROI 테이블 표시를 선택하여 그려진 모든 VOI의 이름을 바꿉니다. 방사능(kBq/mL) 및 종양 부피(mm3)와 같은 필요한 모든 데이터를 스프레드시트에 기록합니다. VOI 도면의 사본을 저장하고 완료되면 원시 및 재구성 된 이미징 데이터를 외장 하드 드라이브에 보관합니다.
    7. 다음 방정식11을 사용하여 모든 VOI에 대한 표준화된 흡수 값(SUV)을 계산합니다.
      SUV = CPET(t)/(ID/BW)
      여기서 CPET(t)는 VOI에서 측정된 활성, ID 는 kBq 단위로 측정된 주입 용량, BW 는 조직 밀도가 1g/mL라고 가정할 때 마우스 체중(kg)입니다.

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결과

연속적인 동소 이식에 적합한 종양 블록을 얻기 위해, 먼저 DPBS(MHCC97L 세포 함유)에 200μL의 세포 현탁액을 누드 마우스의 하부 측면 내로 피하 주사하여 안정한 클론을 생성하였다(도 1A). 종양 성장을 모니터링하고, 종양 크기가 800-1000 mm3 (주사 후 약 4주)에 도달했을 때, 마우스를 안락사시키고, 생성된 종양 블록을 누드 마우스의 또 다른 배치 내로의 후속 간 동소 이식을 위해 대략 1mm3 단편으로 절단하였다 (n = 6). 마우스를 대조군(C1, n=3)과 간동맥 결찰(H2, n=3)의 두 그룹으로 무작위 배정했습니다. HAL은 간동맥의 주가지 주위에 가는 실을 묶어 수행되었습니다. C1 마우스는 동소 이식 전에 HAL로부터 보호되었다. 이 조작은 H2에서 종양 저산소증을 유발했지만 C1 마우스에서는 그렇지 않았으며 종양 저산소 상태는 PET 저산소 추적자 [18F]FMISO를 사용하...

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토론

이 연구에서 우리는 [18F]FMISO 및 [18F]FDG PET/MR을 사용하여 동소 이종 이식편에서 종양 저산소증의 비침습적 모니터링 방법과 함께 피하 종양을 사용하여 간 동소 HCC 이종이식편에 HAL을 수행하는 절차를 설명했습니다. 우리의 관심은 조기 진단 및 치료 반응 평가를 위한 다양한 암 및 질병 모델의 대사 영상에 있습니다11,13,14,15. 현재까지 HAL HCC 이종이식의 생성과 생체 내 종양 대사는 문헌에 거의 설명되지 않았으며, 이로 인해 PET 이미징을 사용하여 이러한 종양 모델의 대사 특성을 조사하게 되었습니다.

HCC에서 저산소증을 연구하기 위한 강력한 마우스 모델로서 ...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

우리는 작은 동물 이미징 실험에 대한 홍콩 항암 신탁 기금, 홍콩 연구 보조금 위원회 공동 연구 기금(CRF C7018-14E)의 지원을 인정합니다. 또한 [18F]FMISO 및 [18F]FDG를 제공한 홍콩 대학교의 MIMCC(Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center)의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 멸균 식염수BbraunN/A0.9% 염화나트륨 정맥 주입, 500mL
10# 메스 블레이드RWD Life Science Co.,ltdS31010-01동물 수술 도구
10% 포비돈-요오드 용액Banitore6.425.678소독용
1mL 주사기가 있는 25G 바늘BD PrecisionGlideN/A세포 현탁액 주입용 25G 바늘이 있는 1mL 주사기
5mL 주사기TerumoSS05L5mL 주사기 Luer Lock
70% 에탄올Merck1.07017소독용
자동 세포 계수기InvitrogenAMQAF2000자동 세포 계수용
부프레노르핀HealthDirectN/A피하 주사(0.05-0.2mg/kg/12시간) 수술 후 진통제
세포 배양 접시 (직경 60 mm)Thermo Scientific150462종양 조직 처리용
원심분리기Sigma3-16KL, 고정각 로터 12311세포 현탁액 채취용
원심분리기 Conical TubeEppendorfEP0030122151세포 현탁액 채취용
배양 배지(Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체)Gibco10566024고포도당, GlutaMAX™ 보충제
디지털 캘리퍼스RS PRO841-2518피하 종양 크기 측정용
직접 열 CO2 incubatorTechcomp LimitedNU5841세포 배양
용량 캘리브레이터Biodex  N/AAtomlab 500
DPBS(둘베코' s 인산염 완충 식염수)Gibco14287072세포 세척 및 주입용
눈 윤활제Alcon Duratears  N/A멸균 안구 윤활제 연고, 3.5g
혈청(FBS)GibcoA4766801광범위한 세포 유형, 특히 민감한 세포주에 사용
겸자(곡선, 미세하고 곧은 무딘)RWD Life Science Co., ltdF12012-10 & F12011-13동물 수술 도구
가열 패드ALA Scientific InstrumentsN / A수술 중 마우스 용 열 패드
인슐린 주사기Terumo10ME2913방사선 추적자 주입 용 바늘이있는 1 mL 인슐린 주사기
InterView 융합 소프트웨어Mediso버전 3.03후 처리 및 이미지 분석 소프트웨어
도립 현미경Yu Lung Scientific Co., LtdBM-209G세포 형태학 시각화
IsofluraneChanelle Pharma  N/AIso-Vet, 흡입 마취제, 250mL
케타민Alfasan International BVHK-37715케타민 10% 주입 용액, 10 mL 
의료용 산소Linde HKO101-HR압축 가스, 99.5% 순도
nanoScan PET/MR 스캐너Mediso  N / A3 테슬라 MR
바늘 홀더RWD 생명 과학 유한 공사F31026-12동물 수술 도구
Nucline nanoScan 소프트웨어Mediso버전 3.0스캐너 운영 소프트웨어
나일론 봉합사 (6/0 및 5 / 0)Healthy Medical Company Ltd000524 & 000526동물 수술 도구
페니실린- 스트렙토 마이신Gibco1514012250 내지 100 I.U./mL 페니실린 및 50 내지 100 &마이크로의 최종 농도를 위한 배양 배지; g/mL 스트렙토마이신.
펜타바르비탈알파메딕13003생쥐의 호흡 정지 유도를 위한 복강내 주사(330 mg/kg)
날카로운 가위RWD 생명 과학S14014-10동물 수술 도구
봄 가위RWD 생명 과학 주식회사S11005-09동물 수술 도구
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061세포 계수용
트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 0.25%), 페놀 레드.Gibco25200072세포 분해용
자일라진알파산 인터내셔널 B.V.HK-56179자일라진 2% 주사액, 30mL
소 태아

참고문헌

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  9. Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
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  11. Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460(2021).
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