AlPcS2a 매개 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)는 살아있는 세포에서 세포내 소포(IV)의 시공간 손상을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포내 소포(IV)는 소포가 세포질로 세포내로 세포내이입되는 것을 통해 형성됩니다. IV 형성은 IV 막의 투과화와 엔도솜 및 리소좀의 형성을 통해 다양한 신호 경로를 활성화하는 데 관여합니다. 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)라는 방법이 IV 형성과 IV 조절을 제어하는 재료를 연구하는 데 적용됩니다. CALI는 막 투과화에 의해 유도된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 이미징 기반 광역학 방법론입니다. 이 방법을 사용하면 선택된 세포 기관의 시공간 조작이 세포에서 투과될 수 있습니다. CALI 방법은 엔도솜과 리소좀의 투과를 통해 특정 분자를 관찰하고 모니터링하는 데 적용되었습니다. IV의 막 파열은 갈렉틴-3과 같은 글리칸 결합 단백질을 선택적으로 모집하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서 프로토콜은 AlPcS2a 에 의한 IV 파열 유도와 손상된 리소좀을 표지하기 위한 마커로 갈렉틴-3의 사용을 설명하며, 이는 IV 막 파열의 다운스트림 효과와 다양한 상황에서 다운스트림 효과를 연구하는 데 유용합니다.
서론
세포내 소포(IV)의 일종인 엔도솜은 엔도사이토시스에 의해 형성되고 리소좀으로 성숙합니다. 다양한 세포 내 신호 경로가 IV의 형성에 관여합니다. 또한, 상이한 내인성 및 외인성 자극이 IV를 손상시킬 수 있습니다(예: 병원체는 감염 중에 경계막에서 빠져나와 세포질1로 들어갈 수 있음). 이것은 일반적으로 endocytotic vesicle의 파열을 동반합니다2. 따라서 IV를 표적화하고 손상시키는 기술은 관련 연구에서 사용될 수 있다3.
광역학 치료(Photodynamic therapy, PDT)는 종양이나 병원체를 죽임으로써 질병을 퇴치하기 위한 빛 의존 요법이다4. PDT에서, 표적 세포는 광감작제라고 불리는 비독성 발색단으로 표지되며, 이는 광 조명 5,6에 의해 국소적으로 활성화될 수 있다. 감광제는 빛에서 에너지를 흡수하여 여기된 일중항 상태로 변환되어 수명이 긴 여기된 삼중항 상태로 이어집니다. 삼중항 상태의 광감작제는 전자 또는 에너지 전달을 겪을 수 있고....
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프로토콜
1. AlPcS2a 재고 준비
- 10mg의 AlPcS2a 를 400μL의 0.1M NaOH에 녹입니다. 용해도를 향상시키기 위해, 용액을 50°C에서 가열하고 와동시킨다.
- 용액을 4mL의 인산염 완충 식염수(PBS)와 혼합합니다. 그 후, 용액을 0.22 μm 필터로 여과하여 불용성 침전물을 제거하였다.
- UV-Vis 분광광도계를 통해 용액의 농도를 측정합니다. 672 nm에서 AlPcS2a의 흡광 계수는 4 x 104 cm-1 M-1입니다. AlPcS2a 용액을 PBS로 희석하여 1 mM 용액을 만든다. 1 mL 분취량을 만들고 -20 °C에서 보관한다.
2. 형질주입
참고: Gal3-GFP는 리소좀 파열의 생세포 이미징을 위한 지표로 적용됩니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM에서 HeLa 세포 배양을 유지합니다. 세포를 PBS로 세척한 후, 세포를 트립신화한 다음, 10% FBS가 보충된 DMEM에서....
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결과
엔도솜과 리소좀을 포함한 IV의 AlPcS2a 유발 손상을 나타내는 개략도가 표시되었습니다(그림 1).
시판되는 마커는AlPcS2a 염색 조건을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, AlPcS2a 반점 및 녹색 형광 염료22 colocalization (그림 2).
형광단 표지된 갈렉틴-3은 IV 손상을 모니터링하기 위한 지표로 적용할 수 있습니다(그림 3). 또한, Gal3 반점의 위치는 리소좀 복구 및 lysophagy 3,23을 포함한 다운스트림 신호 전달 .......
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토론
AlPcS2a는 원형질막에 결합한 다음 엔도사이토시스에 의해 내재화되어 결국 리소좀에 축적됩니다. 따라서 AlPcS2a는 배양 기간을 조정하여 세포하 구획에 국한시킬 수 있습니다. 이 방법론의 한계는 ER 및 골지체와 같은 IV의 다른 막 공급원이 많기 때문에 엔도사이토시스를 통해 IV의 하위 집단만 AlPcS2a에 의해 표지될 수 있다는 것입니다. 또한, AlPcS2a를 초기 또는 후기 엔도솜에 선택적으로 표지하는 것은 어려울 수 있지만, 형광 마커를 사용하여 세포 내 이미징 중에 초기 형성된 엔도솜과 후기 형성된 엔도솜을 구별할 수 있습니다. CALI-유도된 IV 손상은 다양한 염료 3,24로 유도될 수 있다.
손상의 강도는 빛의 힘과 조명 지속 시간에 의해 제어될 수 있습니다. 손상 강도가 높.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 연구 지원을 위해 Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS에 감사드립니다. 핵심 시설은 Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213)의 자금 지원을 받습니다. 저자는 이미지 획득을 지원해 준 IBMS(Institute of Biomedical Sciences), AS(Academia Sinica)의 Common Equipment Core Facility에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| Al(III) 프탈로시아닌 클로라이드 디설폰산(AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| 배양 접시 | ibidi | 812128-200 | |
| 10% FBS 및 100 U/mL 페니실린 G 및 100 mg/mL 스트렙토마이신 DMEM이 보충된 | 배양 배지 | ||
| Gibco | 11965092 | ||
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP 플라스미드 | 애드진 | ||
| Lipofectamine 3000 키트 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | 녹색 형광 염료 |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140163 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa 세포주 | ATCC | CCL-2 | 이 방법은 부착된 대부분의 세포주에 적용할 수 있습니다. 조건은 개별적으로 결정해야 합니다. |
| Equipments | |||
| 0.22 &마이크로; m 필터 | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 및 DC2100 | 근적외선 광은 AlPcS2a의 여기 스펙트럼에 이상적인 기반입니다. |
| 컨포칼 현미경 검사 | Carl Zeiss | LSM 780 | 장기 이미징을 위해서는 배양 시스템이 필요합니다. |
| NanoDrop 2000/2000c 분광 광도계 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 적색 LED 조명 | Tholabs | M660L4-C1 |
참고문헌
- Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective....
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재인쇄 및 허가
