장 유래 미생물 대사 산물은 동물에서 복잡한 행동으로 이어지는 다면적 효과가 있습니다. 우리는 가이드 캐뉼러를 통한 뇌실 내 전달을 통해 뇌에서 장 유래 미생물 대사 산물의 효과를 설명하는 단계별 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.
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방법 논문
자유롭게 움직이는 마우스에서 장 유래 미생물 대사 산물의 뇌실 내 전달
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
장내 미생물총과 그 대사 산물이 숙주 생리학 및 행동에 미치는 영향은 지난 10년 동안 광범위하게 조사되었습니다. 수많은 연구에 따르면 장내 미생물총에서 파생된 대사 산물은 숙주의 복잡한 장-뇌 경로를 통해 뇌 매개 생리 기능을 조절합니다. 단쇄 지방산(SCFA)은 장내 마이크로바이옴에 의해 식이 섬유 발효 중에 생성되는 주요 박테리아 유래 대사 산물입니다. 장에서 분비된 SCFA는 말초의 여러 부위에서 작용하여 SCFA 수용체의 광대한 분포로 인해 면역, 내분비 및 신경 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 SCFA의 경구 및 복강 내 투여를 통해 SCFA의 중추 및 말초 효과를 구별하는 것은 어렵습니다. 이 논문은 자유롭게 움직이는 마우스에서 가이드 캐뉼러를 통해 뇌에서 SCFA의 기능적 역할을 조사하는 비디오 기반 방법을 제시합니다. 뇌에서 SCFA의 양과 유형은 주입량과 속도를 조절하여 조정할 수 있습니다. 이 방법은 과학자들에게 뇌에서 장 유래 대사 산물의 역할을 이해하는 방법을 제공 할 수 있습니다.
서론
인간의 위장관에는 숙주 1,2,3에 영향을 미치는 다양한 미생물이 있습니다. 이 장내 박테리아는 숙주 4,5가 소비하는식이 성분을 활용하는 동안 장 유래 대사 산물을 분비 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 말초에서 대사되지 않은 장 대사 산물은 순환을 통해 다른 기관으로 운반 될 수 있습니다6. 참고로, 이러한 분비 된 대사 산물은 중추 신경계와 장7 사이의 양방향 통신으로 정의되는 장-뇌 축의 매개체 역할을 할 수 있습니다. 이전 연구에 따르면 장 유래 대사 산물은 동물의 복잡한 행동과 감정을 조절할 수 있습니다 8,9,10,11.
단쇄 지방산 (S....
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프로토콜
모든 실험 프로토콜과 동물 관리는 국립 쳉쿵 대학교 (NCKU) 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 실험동물에 대한 준비
- 공급 업체로부터 6-8 주 된 야생형 C57BL / 6JNarl 수컷 마우스를 구하십시오.
- 표준 마우스 케이지에 마우스를 수용하고 표준 마우스 차우와 멸균 된 물을 자유롭게 만듭니다.
참고: NCKU 실험실 동물 센터의 주거 조건은 22 ± 1 ° C 온도, 55 % ± 10 % 습도 및 13 시간 / 11 시간 명암 사이클입니다.
2. 정위 수술
- 정위 도구, 수술 도구 및 관련 품목을 준비하고 살균하십시오.
알림: 수술 부위에 직접 접촉하는 모든 품목은 감염을 피하기 위해 멸균해야합니다. - 마우스를 산소에서 1 % -5 % 이소 플루 란으로 플렉시 글라스 케이지에 넣어 마취하십시오.
알림: 마우스를 면밀히 관찰하여 호흡 속도가 초당 약 1회 호흡으로 유지되는지 확인하십시오. - 마우스를 마취실에서 꺼냅니다. 애완 동물 트리머로 수술 부위 (마우스 머리)....
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결과
마우스를 가이드 캐뉼라 이식으로부터 회복된 지 1주일 후에 SCFA를 주입하여 신규한 케이지에서 운동 활성을 평가하였다. 마우스를 새로운 케이지에 넣고 뇌의 측면 심실에 이식 된 상업용 가이드 캐뉼라를 통해 처음 5 분 동안 2,100nL의 SCFA 또는 ACSF (7nL / s의 전달 속도)를 뇌에 주입했습니다. 새로운 케이지에서의 운동 활동은 주입 후 추가로 30 분 동안 기록되었습니다. SCFAs와 ACSF의 주입 사이의 신규한 케이지에서 운동 활성에는 차이가 관찰되지 않았다 (그림 6) (n = 그룹당 2 마우스; 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 표시되고 양방향 ANOVA로 분석됨).
뇌 영역에서 가이드 캐뉼라의 이식 정확도를 검증하기 위해 SCFA와 동일한 부피 및 전달 속도(5분에 2,100nL, 7nL/s)로 가이드 캐뉼라를 통해 마우스에 형광 신경 추적자를 주입했습니다. 뇌는 30 분 후에 조직.......
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토론
장 유래 대사 산물은부분적으로 신체의 여러 결합 부위 6,12,24로 인해 많은 정확한 메커니즘없이 뇌 매개 질환과 관련이 있습니다. 이전 보고서에 따르면 SCFA는 G 단백질 결합 수용체, 후성 유전 조절자 및 신체의 여러 부위에서 에너지 생산 원을위한 리간드 역할을 할 수 있습니다 6,12. 말초에서 발생하는 교란 요인 (예 : 면역 세포, 호르몬 및 자율 신경계)을 우회하기 위해 자유롭게 움직이는 마우스에서 가이드 캐뉼러를 통해 뇌에 SCFA를 뇌실 내 주사하는 방법을 채택하여 개발되었습니다. 또한, 캐뉼러화 및 주입 부위는 SCFA의 영향을 받을 수 있는 뇌 영역을 탐색하기 위해 검증되었습니다. 전체적으로이 논문은 장 뇌 축 연구를 위해 장 유래 대사 .......
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공개 사항
저자는이 작업과 관련하여 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는 동물을 돌보는 국립 쳉쿵 대학교 (NCKU)의 실험실 동물 센터 직원을 인정합니다. 이 작업은 CHENG-HSING 의료 재단의 Kun-Yen Huang 교수 교육 기금에서 C.-WL에 대한 장학금으로 지원되었습니다. 대만 과학 기술부 (MOST)의 기금 : (학부 연구 MOST 109-2813-C-006-095-B) TO T.-H.Y.; (대부분 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3)에서 W.-L.W.로; 그리고 고등 교육 새싹 프로젝트, 교육부에서 NCKU에서 W.-L.W까지의 대학 진흥 본부에
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 | Pfizer | n/a | |
| Alexa Fluor 488 당나귀 안티-토끼 | ThermoFisher Scientific | A-21206 | |
| Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) | Millipore | AB153-I | |
| Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μ m, PES, 멸균 | NEST | 121921LA01 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | ACSF: 0.14g/L |
| 클로르헥시딘 스크럽 2% | Phoenix | NDC 57319-611-09 | |
| 클로르헥시딘 용액 | Phoenix | NDC 57319-599-09 | |
| 상업용 더미 | RWD Life Science | 62004 | Single_OD 0.20mm/M3.5/G = 0.5mm |
| 상업용 가이드 캐뉼Single_OD | RWD Life Science | 62104 | 0.41mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm |
| 상업용 인젝터 | RWD Life Science | 62204 | Single_OD 0.21 mm-33G/ M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | ACSF: 0.61 g/L |
| 치과용 아크릴 | HYGENIC | n/a | |
| 고정 나사 | RWD Life Science | 62521 | |
| Abcam | AB104139 | 있는 Fluoroshield 장착 매체 | |
| 말 세럼 | ThermoFisher Scientific | 16050130 | |
| 인슐린 주사기 | BBraun | XG-LBB-9151133S-1BX | 1 mL |
| Isoflurane | 파니온 & BF 바이오테크 | DG-4900-250D | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACSF: 0.19 g/L |
| 케토프로펜 | 스위스 제약 | n/a | |
| 리도카인 | AstraZeneca | n/a | |
| 저융점 아가로스 | Invitrogen | 16520 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | ACSF: 0.19 g/L |
| 현미경 커버 슬립 | MARIENFELD | 101242 | |
| 현미경 슬라이드 | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001E | |
| 미네랄 오일 라이트, 화이트 NF | Macron Fine Chemicals | MA-6358-04 | |
| NaCl | 시그마-알드리치 | S9888 | ACSF: 7.46 g/L |
| NaH2PO4 | 시그마-알드리치 | S8282 | ACSF: 0.18 g/L |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | ACSF: 1.76 g/L |
| n-부틸 시아노아크릴레이트 접착제 (조직 접착제 접착제) | 3M | 1469SB | 3M Vetbond |
| 신경 추적자 | Santa Cruz | SC-358883 | FluoroGold |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 폴리에틸렌 튜브 | RWD Life Science | 62329 | OD 1.50, I.D 0.50 mm 및 OD 1.09, I.D 0.38 mm |
| Puralube Vet (eye) 연고 | Dechra | ||
| 아세트산 나트륨 | Sigma-Aldrich | S2889 | SCFAs: 13.5 mM |
| 아지드화나트륨 | 시그마-알드리치 | S2002 | |
| 부티르산나트륨 | Sigma-Aldrich | B5887 | SCFAs: 8 mM |
| 프로피온산나트륨 | Sigma-Aldrich | P1880 | SCFA: 5.18mM |
| 스테인리스 가이드 캐뉼라 | Chun Ta 스테인리스강 enterprise CO., LTD. | 해당 없음 | OD 0.63mm; 현지 공급 업체 |
| 스테인리스 인젝터 | Chun Ta 스테인레스 스틸 기업 CO., LTD. | 없음 | OD 0.3mm; 더미는 인젝터로 만들어졌습니다. 현지 공급 업체 |
| Superglue | Krazy Glue | KG94548R | |
| Triton X-100 | Merck | 1.08603.1000 | |
| Equipment | |||
| Cannula holder | RWD Life Science | B485-68217 | |
| 천장 카메라 | FOSCAM | R2 | |
| 디지털 스테레오택시 기기 | 스톨팅 | 51730D | |
| 해부 현미경 | INNOVIEW | SEM-HT/TW | |
| 유리 비드 살균기 | RWD 생명 과학 | RS1501 | |
| 가열 패드 | 스톨팅 | 53800M | |
| 라이카 현미경 | 라이카 | DM2500 | |
| 마이크로 해부 집게 | ROBOZ | RS-5136 | 톱니, 약간의 곡선; 매우 섬세한; 0.5mm 팁 폭; 4" 길이 |
| 마이크로 해부 가위 | ROBOZ | RS-5918 | 4.5" 각도 날카로운 |
| 마이크로 주입 컨트롤러 | 세계 정밀 기기 (WPI) | MICRO2T | SMARTouch 컨트롤러 |
| 미세 주입 주사기 펌프 | 세계 정밀 기기 (WPI) | UMP3T-1 | UltraMicroPump3 |
| 마이크로리터 주사기 | Hamilton | 80014 | 10 µ |
| L 이중 섬유 | 스텝 | LGY-150 | 현지 공급 업체 |
| 애완 동물 트리머 | WAHL | 09962-2018 | |
| Isoflurane | Step | AS-01 | 공급 업체 |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Software< / strong> | |||
| Animal behavior video 추적 소프트웨어 | Noldus | EthoVision | 버전 : 15.0.1416 |
| Leica Application Suite X 소프트웨어 | Leica | LASX | 버전 : 3.7.2.22383 |
참고문헌
- Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).....
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재인쇄 및 허가
