방법 논문

연골 재생을 촉진하기 위한 층별 야누스 베이스 나노매트릭스의 제작 및 특성 분석

DOI:

10.3791/63984

⸱

2022년 7월 6일

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)을 순차적으로 추가하여 층별 야누스 염기 나노 매트릭스 (JBNm) 스캐 폴드의 조립을 설명합니다. JBNm은 제작되고 특성화되었습니다. 또한 우수한 생리활성을 나타내어 부착, 증식 및 분화와 같은 세포 기능을 촉진했습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다양한 생체 재료 스캐폴드는 시험관내 및 생체 내 사용을 위한 특정 기능을 촉진하기 위해 세포 부착 및 증식을 안내하기 위해 개발되었습니다. 이러한 생체 재료 스캐폴드 내로의 성장 인자의 첨가는 일반적으로 최적의 세포 배양 환경을 제공하고, 세포 분화 및 그 후속 기능을 매개하기 위해 수행된다. 그러나, 종래의 생체 재료 스캐폴드 내의 성장 인자는 전형적으로 이식시 방출되도록 설계되어, 주변 조직 또는 세포에 의도하지 않은 부작용을 초래할 수 있다. 여기에서 DNA에서 영감을 받은 야누스 염기 나노매트릭스(JBNm)는 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조로 고도로 국소화된 미세 환경을 성공적으로 달성했습니다. JBNms는 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 생체 친화도를 통해 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)에서 자체 조립됩니다. JBNm은 TGF-β1:matrilin-3:JBNt 비율이 1:4:10으로 조립되었는데, 이는 층별 구조로의 적절한 조립이 발생할 수 있는 결정된 비율이기 때문입니다. 먼저, TGF-β1 용액을 마트릴린-3 용액에 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 JBNt 용액의 첨가 전에 충분한 균질성을 보장하기 위해 수회 피펫팅하였다. 이것은 여러 번 다시 피펫팅한 후 층별 JBNm을 형성했습니다. 층별 JBNm 구조, JBNt 단독, 마트릴린-3 단독, 및 TGF-β1 단독을 특성화하기 위해 다양한 실험을 수행하였다. JBNm의 형성은 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로 연구되었고, JBNm의 구조는 투과 전자 현미경 (TEM)으로 관찰되었습니다. 혁신적인 층별 JBNm 스캐폴드가 분자 규모로 형성됨에 따라 형광 염료 표지 JBNm을 관찰할 수 있었습니다. TGF-β1은 주사 가능한 JBNm의 내부 층 내에 국한되어 주변 부위로의 성장 인자 방출을 방지하고 국소 연골 생성을 촉진하며 항 비대 미세 환경을 촉진 할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

조직 공학의 스캐폴드는 세포 부착 및 후속조직 발달을 위한 구조적 지지를 제공하는 데 중요한 역할을 합니다1. 전형적으로, 어떠한 스캐폴딩도 없는 종래의 조직 구축물은 세포 배양 환경에 의존하고 세포 분화를 매개하기 위해 추가된 성장 인자에 의존한다. 또한, 스캐폴드에 생리활성 분자를 추가하는 것은 종종 세포 분화 및 기능 2,3을 안내하는 데 선호되는 접근 방식입니다. 일부 스캐폴드는 네이티브 조직의 생화학적 미세 환경을 독립적으로 모방할 수 있는 반면, 다른 스캐폴드는 성장 인자를 통해 세포 기능에 직접 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 연구자들은 종종 세포 부착, 성장 및 분화에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 스캐폴드를 선택하는 데 어려움을 겪는 동시에장기간에 걸쳐 최적의 구조적 지지와 안정성을 제공합니다4,5. 생리 활성 분자는 종종 스캐폴드에 느슨하게 결합되어 이식시 이러한 단백질이 빠르게 방출되어 원치 않는 위치에서 방출됩니다. 이것은 의도적으로 표적화되지 않은 조직이나 세포에 대한 부작용으로 절정에 달합니다 6,7.

비계는 일반적으로 고분자 재료로 만들어집니다. 야누스 베이스 나노-매트릭스(JBNm)는 자가 지속 가능한 연골 조직 구축물8을 위한 새로운 층별 방법으로 만들어진 생체모방 스캐폴드 플랫폼이다. 이 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노튜브는 세포외 기질(ECM)에서 발견되는 콜라겐의 구조와 표면 화학을 적절하게 모방하기 때문에 야누스 베이스 나노튜브(JBNts)로 명명되었습니다. JBNm은 matrilin-3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)과 같은 생리 활성 분자를 첨가하여 원하는 세포 및 조직 기능을 자극 할 수있는 최적의 미세 환경을 만들 수 있습니다9.

JBNts는 핵염기 아데닌과 티민의 합성 버전에서 파생 된 새로운 나노 튜브입니다. JBNts는 자체 조립(10)을 통해 형성됩니다. 6 개의 합성 핵염기가 결합하여 고리를 형성하고,이 고리는 π-π 스태킹 상호 작용을 거쳐 길이 200-300 μm의 나노 튜브를 만듭니다11. 이 나노 튜브는 구조적으로 콜라겐 단백질과 유사합니다. 천연 연골 미세 환경의 한 측면을 모방함으로써 JBNts는 연골 세포 및 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)에 유리한 부착 부위를 제공하는 것으로 나타났습니다11,12,13,14. 나노 튜브는 자체 조립을 거치고 어떤 종류의 개시제 (예 : 자외선)도 필요로하지 않기 때문에 도달하기 어려운 결함 영역15에 대한 주사 가능한 스캐 폴드로서의 흥미로운 잠재력을 보여줍니다.

Matrilin-3는 연골에서 발견되는 구조적 세포 외 기질 단백질입니다. 이 단백질은 연골 형성과 적절한 연골 기능에 중요한 역할을합니다16,17. 최근에는 생체 재료 스캐폴드에 포함되어 비대 9,18,19 없이 연골 생성을 촉진합니다. 이 단백질을 JBNm에 포함시킴으로써 연골 세포는 천연 미세 환경과 유사한 구성 요소를 포함하는 스캐 폴드에 끌립니다. 또한, 마트리린-3은 연골세포20 내에서 적절한 TGF-β1 신호전달을 위해 필요한 것으로 나타났다. 성장 인자는 신호 분자로 기능하여 특정 세포 또는 조직의 특정 성장을 유발합니다. 따라서 최적의 연골 재생을 달성하기 위해 매트릴린-3 및 TGF-β1은 JBNm 내의 필수 구성 요소입니다. 층별 스캐폴드 내로 TGF-β1을 첨가하면 조직 구축물에서 연골 재생을 더욱 촉진할 수 있다. TGF-β1은 연골 결손의 치유 과정을 촉진하고 연골 세포 및 hMSC 증식 및 분화를 촉진하는 데 사용되는 성장 인자입니다21,22. 따라서 TGF-β1은 연골 재생 JBNm (J / T / M JBNm) 23에서 중요한 역할을하며, 특히 JBNm 층 내에 국한 될 때 적절한 성장을 촉진합니다.

앞서 언급했듯이 성장 인자는 일반적으로 특정 혼입 방법 없이 스캐폴드 외부에 조립됩니다. 여기에서 생체 재료의 정밀하게 설계된 나노 아키텍처를 통해 JBNm은 의도된 세포와 조직의 특정 표적화를 위해 개발되었습니다. JBNm은 내층의 JBNt 표면에 부착된 TGF-β1과 외층(24,25)의 JBNt 표면에 부착된 마트릴린-3으로 구성된다. 층별 구조의 내부 층에 TGF-β1을 혼입하면 JBNm 섬유를 따라 고도로 국소화된 미세 환경을 허용하여 단백질12의 훨씬 느린 방출을 갖는 항상성 조직 구축물을 생성합니다. JBNm의 주입성은 다양한 미래의 생체 재료 응용 분야에 이상적인 연골 조직 구조물입니다26.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. JBNts의 합성

  1. 다양한 화합물12의 합성을 수반하는 이전에 공개된 방법을 활용하여 JBNt 단량체를 제조한다.
  2. 조 JBNt 단량체가 합성된 후 역상 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제합니다. 용매 A : 100 % 물, 용매 B : 100 % 아세토 니트릴 및 용매 C : pH = 1의 HCl 수용액을 사용하십시오. 3mL/분의 유속을 사용하십시오. HPLC에서 얻은 가장 큰 피크를 7.2분에 수집한다.

2. JBNt / Matn1 / TGF-β1 제작 (비디오 1)

알림: 비디오 1 은 JBNm이 생리적 환경(수용액, 자외선 없음, 화학 첨가물 없음 및 가열 없음)에서 형성된 주사 가능한 고체임을 보여주며, 이는 생물학적으로도 영감을 받았습니다.

  1. H2O에 현탁 된 1 mg / mL TGF-β1 8 μL를 H2O에 현탁 된 1 mg / mL matrilin-3 3 32 μL에 첨가하여 이러한 단백질의 적절한 혼합을 보장합니다.
  2. H2O에 현탁된 1mg/mL JBNts 80μL를 TGF-β1/마트리린-3 용액에 첨가합니다. 적절한 혼합을 위해 반복적으로 피펫팅하십시오. 백색 응집의 존재는 JBNt의 첨가 직후에 관찰 될 수 있으며, 이는 JBNm의 형성을 나타냅니다 (비디오 1).

3. 자외선 가시광선(UV-Vis) 흡수가 있는 검체 관찰

참고: UV-Vis 흡수 스펙트럼은 JBNm의 어셈블리를 특성화하기 위해 연구되었습니다. 이 측정은 JBNt 단독, 마트릴린-3 단독, TGF-β1 단독, 및 세 부분으로 구성된 전체 층별 JBNm의 네 가지 범주에 대해 분석되었습니다. 모든 초기 농도는H2O에 현탁된다.

  1. JBNt 그룹의 경우 5μL의H2O에 1mg/mL JBNt 50μL를 추가하여 90.9μg/mL 용액을 만듭니다.
  2. matrilin-3 그룹의 경우 40μL의 10μg/mL matrilin-3을 15μL의H2O에 추가하여 7.3μg/mL 용액을 만듭니다.
  3. TGF-β1 그룹의 경우 10μL의 10μg/mL TGF-β1을 45μL의H2O에 추가하여 1.8μg/mL 용액을 만듭니다.
  4. JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 마트릴린-3 40μL를 10μg/mL TGF-β1 10μL에 추가합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 교반한 다음 5μL의 1mg/mL JBNts를 용액에 첨가하고 반복적으로 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
  5. 분광 광도계를 사용하여 각 그룹의 흡수 스펙트럼을 측정합니다.

4. 시편의 제타 전위 측정

참고: JBNm이 생체 내 조직과 어떻게 상호 작용하는지 더 잘 예측하기 위해 제타 전위를 분석했습니다. 세 그룹이 측정되었다: 마트릴린-3 단독, TGF-β1을 사용한 매트릴린-3, 및 전체 층별 JBNm.

  1. matrilin-3 그룹의 경우 160μL의 10mg/mL matrilin-3을 640μL의H2O에 추가하여 800μL 용액을 만듭니다.
  2. 매트릴린-3/TGF-β1 화합물의 경우 10μg/mL 매트린-3 160μL를 10μg/mL TGF-β1 40μL에 추가합니다. 적절한 균질성을 보장하기 위해 반복적으로 피펫팅하십시오. 이어서, 이를 600 μL의H2O에 첨가하여 800 μL 용액을 생성한다.
  3. JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 매트린-3 160μL를 10μg/mL TGF-β1 40μL에 추가합니다. 단백질을 혼합하기 위해 여러 번 피펫팅하십시오. 그런 다음 균질성을 보장하기 위해 용액과 피펫에 1mg/mL JBNts 20μL를 추가합니다. 마지막으로, JBNm 용액을 580 μL의H2O에 첨가하여 800 μL 용액을 생성한다.
  4. 세 그룹에 대한 제타 전위 값을 측정합니다.

5. 투과전자현미경(TEM)을 위한 JBNt/마트릴린-3 나노매트릭스의 제조

참고 : TEM 특성화는 JBNts 및 JBNm의 형태를 특성화하기 위해 수행됩니다.

  1. 두 개의 그리드를 플라즈마 클리너에 삽입하여 게시된 프로토콜 및 제조업체의 프로토콜12에 따라 JBNts 및 JBNm의 음성 염색 전에 그리드를 적절하게 청소합니다.
  2. 10μL의 1mg/mL JBNt와 40μL의 증류수를 혼합하여 200μg/mL JBNt 용액을 만듭니다.
  3. 30μL의 100μg/mL 매트릴린-3을 20μL의 100μg/mL TGF-β1 및 피펫과 여러 번 혼합합니다. 10 μL의 1 mg / mL JBNts를 matrilin-3 / TGF-β1 혼합물에 첨가하여 JBNm 샘플을 준비합니다. 다시, 반복적으로 피펫.
  4. 3μL의 JBNt 용액(200μg/mL)과 3μL의 JBNm 용액을 별도의 그리드에 추가하고 2분 동안 그대로 두십시오.
  5. 각 그리드를 100 μL의 우라닐 아세테이트 용액 (0.5 %)으로 헹굽니다. 여과지를 사용하여 여분의 용액을 제거하고 그리드를 자연 건조시킵니다.
  6. 투과 전자 현미경을 작동하여 이전에 발표 된11,12와 같이 샘플을 적절하게 관찰하고 특성화합니다.

6. 형광표지 단백질의 흡수 스펙트럼 측정

참고 : JBNm의 구조는 흡수 스펙트럼 분석을 통해 JBNm의 구조를 관찰하여 검증됩니다.

  1. 제조업체의 지침에 따라 단백질 라벨링 키트를 사용하여 TGF-β1에 라벨을 붙입니다. 20 μL의 20 μg/mL 표지된 TGF-β1을 25 μL의 H2O에 첨가하여 8.9 μg/mL 시험 용액을 만듭니다.
  2. 별도의 라벨링 키트를 사용하여 matrilin-3에 라벨을 붙입니다. 20 μL의 80 μg/mL 표지된 매트린-3을 25 μL의H2O에 첨가하여 36 μg/mL 시험 용액을 만듭니다.
    참고 : TGF-β1의 형광 염료 라벨링은 최종 농도가 20 μg / mL 인 반면, matrilin-3의 라벨링은 최종 농도가 80 μg / mL입니다.
  3. 20 μL의 80 μg/mL 표지된 매트린-3을 20 μL의 20 μg/mL 표지된 TGF-β1 및 5 μL의 H2O와 혼합하면 표지된 TGF-β1/matrilin-3 화합물이 생성됩니다. 혼합물을 여러 번 피펫팅하여 혼합하십시오.
  4. 40 μL의 H2O에 5 μL의 1 mg / mL JBNts를 첨가하여 111 μg / mL 용액을 만듭니다.
  5. 20μL의 20μg/mL 표지된 TGF-β1을 80μg/mL로 표지된 매트린-3 및 피펫 20μL에 여러 번 추가합니다. 표지된 TGF-β1/매트린-3 용액에 5μL의 1mg/mL JBNts를 추가하고 화합물을 적절하게 혼합하기 위해 반복적으로 피펫팅합니다.
    참고 : JBNt, 표지 된 TGF-β1 및 표지 된 matrilin-3 샘플의 최종 농도는 각각 111 μg / mL, 8.9 μg / mL 및 36 μg / mL였습니다.
  6. 각 샘플 그룹 (즉, 표지 된 TGF-β1 (단계 6.1), 표지 된 매트린 -3 (단계 6.2), 표지 된 TGF-β1 / 마트릴린 -3 (단계 6.3), JBNts (단계 6.4), JBNm (단계 6.5))을 검은 색 384 웰 플레이트의 자신의 웰로 옮깁니다.
  7. 검은색 384웰 플레이트를 다중 모드 마이크로플레이트 리더에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 488nm 및 555nm의 여기 파장에서 측정합니다.

7. 시험관 내 생물학적 기능 분석

  1. 사전 코팅된 커버 유리 챔버의 세포 접착력 테스트
    1. 각 셀 유형에 하나의 커버 글라스가 사용되므로 5 개의 샘플 그룹으로 2 개의 챔버 커버 글라스를 준비하십시오.
    2. 198.75μL의 증류수에 1.25μL의 1mg/mL JBNts를 첨가하여 6.25μg/mL 용액을 생성합니다.
    3. 190μL의 증류수에 10μL의 10μg/mL 매트린-3을 추가하여 0.5μg/mL 용액을 만듭니다.
    4. 197.5 μg/mL의 증류수에 10 μg/mL TGF-β1 2.5 μL를 첨가하여 0.125 μg/mL 용액을 만듭니다.
    5. JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 매트린-3 10μL를 10μg/mLTGF-β1 및 피펫 2.5μL에 추가합니다. 1 mg/mL 농도의 JBNts 1.25 μL를 혼합물 용액과 피펫에 추가합니다. 마지막으로 186.25μL의 증류수를 추가하여 200μL JBNm 용액을 만듭니다.
      1. 대조군의 경우 200μL의 증류수를 사용하십시오.
    6. 각 샘플 그룹을 No. 1.5 챔버 커버 글라스의 자체 웰에 추가하십시오. 커버 글라스를 -80 °C 냉동고에 1 시간 동안 넣은 다음 동결 건조기 기기로 동결 건조시킵니다.
    7. 준비된 챔버 커버 글라스의 각 웰에 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)와 인간 연골세포 세포(웰당 10,000개 세포)를 시드합니다.
    8. 두 개의 커버 글라스를 37°C 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다. 이어서, 세포 배양 배지를 흡인하고 PBS로 2회 헹굽니다.
    9. 세포를 4% 파라포름알데히드로 5분 동안 고정한 다음 PBS로 샘플을 제거하고 헹굽니다. 샘플을 두 번째로 헹구어 4% 파라포름알데히드를 완전히 제거합니다.
    10. 세포를 100 μL의 0.1% 트리톤-X로 10분 동안 배양하고 PBS로 세척한다. 각 웰에 0.165μM 로다민-팔로이딘 100μL를 추가합니다. 30분 동안 기다렸다가 PBS로 다시 씻습니다.
    11. 각 웰에 0.1μg/mL DAPI를 추가하여 핵을 염색합니다. 5 분 동안 기다렸다가 PBS로 웰을 두 번 헹굽니다.
    12. 스펙트럼 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 형태를 관찰하고 형광 이미지를 캡처합니다.
    13. 또한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 세포 수와 형태를 분석합니다. 소프트웨어를 열고 이미지를로드하십시오. 스케일 바를 추가하고 소프트웨어를 보정합니다. 각 샘플에 대해 주어진 영역의 셀 수를 계산합니다. 그런 다음 측정 도구를 사용하여 각 샘플의 세포 형태에 대한 데이터를 수집합니다.
  2. 세포 증식
    1. 3개의 처리되지 않은 96웰 플레이트를 준비하고 각각에 5개의 샘플 그룹을 추가합니다.
      1. JBNt 그룹의 경우 증류수 596.25μL에 1mg/mL JBNts 3.75μL를 추가하면 농도가 6.25μg/mL인 600μL JBNt 용액이 생성됩니다.
      2. TGF-β1 그룹의 경우 592.5μL의 증류수에 10μg/mL TGF-β1 7.5μL를 추가하여 0.125μg/mL의 테스트 용액을 만듭니다.
      3. matrilin-3 그룹의 경우 30μL의 10μg/mL matrilin-3을 증류수 570μL에 추가하여 0.5μg/mL 테스트 용액을 만듭니다.
      4. JBNm 그룹의 경우 7.5μL의 10μg/mL TGF-β1과 30μL의 10μg/mL 매트릴린-3 및 피펫을 여러 번 혼합한 다음 3.75μL의 1mg/mL JBNts를 용액에 추가합니다.
      5. JBNt 용액 558.75μL를 증류수로 희석하여 JBNt, TGF-β1 및 matrilin-3 샘플에 대해 각각 6.25μg/mL, 0.125μg/mL 및 0.5μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.
      6. 대조군의 경우 600μL의 증류수를 사용하십시오.
    2. 각 샘플 그룹을 6개의 웰(웰당 샘플 100μL)로 나눕니다.
    3. 모든 샘플이 들어 있는 3개의 플레이트를 -80°C 냉동고에 1시간 동안 넣은 다음 동결건조 기기로 동결건조합니다.
    4. 이 플레이트에 hMSC를 시드하고, 각각 5,000개의 세포를 포함하는 100μL 세포 현탁액(웰당)을 받습니다. 3개의 플레이트를 5%CO2에서 1일, 3일, 또는 5일 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
    5. 10 μL의 CCK-8 용액을 세포와 함께 각 웰에 첨가하고 37 °C에서 2 시간 더 배양한다.
    6. 450nm에서 다중 모드 마이크로플레이트 리더로 각 웰의 흡수 값을 측정합니다.
    7. hMSC의 알려진 기울기를 96웰 플레이트에 시드하고 4시간 동안 배양합니다. CCK-8 분석을 사용하여 알려진 세포 수의 흡수 값을 측정하고 표준 곡선을 생성합니다.
    8. 흡수 표준 곡선을 사용하여 세포 증식을 계산합니다.
  3. 안정성 테스트
    참고: 인간 TGF-β1 표적 ELISA 키트를 사용하여 아가로스 히드로겔에서 JBNm으로부터 TGF-β1의 백분율 방출을 측정하였다.
    1. PBS 20mL에 아가로스 분말 400mg을 첨가하고 100°C까지 가열하여 2% 아가로스를 제조하여 아가로스 분말을 완전히 용해시킨다.
    2. 냉각된 2% 아가로스 하이드로겔 내부에 JBNm을 준비한다.
      1. 10 μL의 10 μg/mL TGF-β1, 40 μL의 10 μg/mL 마트리린-3, 5 μL의 1 mg/mL JBNts 및 195 μL의 PBS를 결합합니다. 이 용액을 2 % 아가 로스 250 μL와 혼합하여 JBNm 하이드로 겔을 만듭니다.
    3. 500μL의 PBS를 방출 용액으로 사용하여 추가하고 3일마다 교체하십시오. 방출 된 모든 용액을 보관하고 샘플을 15 일 동안 그대로 두십시오.
    4. ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 캡처된 각 릴리스 솔루션을 테스트합니다.
      참고 : 이론적 로딩 값 100 %에서 PBS에서 방출되는 TGF-β1의 양을 빼면 TGF-β1의 잔량을 결정할 수 있습니다.
  4. PCR26을 이용한 세포 분화 분석.
    1. 20 μL의 세포 현탁액 (4 x 104 세포), 30 μL의 특정 용액 (또는 샘플 그룹에 따라 PBS), 및 50 μL의 2 wt% 아가로스를 함유하는 각각의 샘플로 7개의 샘플 그룹을 준비한다.
      1. TGF-β1 그룹의 경우 10μg/mL TGF-β1 5μL를 PBS 25μL에 추가하여 1.6μg/mL 용액을 만듭니다.
      2. matrilin-3 그룹의 경우 10μg/mL matrilin-3 20μL를 PBS 10μL에 추가하여 6.7μg/mL 용액을 만듭니다.
      3. JBNt 그룹의 경우 27.5μL의 PBS에 2.5μL의 1mg/mL JBNt를 추가하면 83.3μg/mL 용액이 생성됩니다.
      4. J/T/M JBNm 그룹의 경우 10μL의 10μg/mL 매트린-3에 5μL의 10μg/mL TGF-β1과 피펫을 위아래로 추가하여 용액을 혼합합니다. 그런 다음 2.5μL의 1mg/mL JBNt와 피펫을 다시 추가합니다. 마지막으로 2.5μL의 PBS로 희석합니다.
      5. 각 대조군에 대해 30μL의 PBS를 샘플로 사용합니다.
    2. 각 웰에 0.5mL의 세포 배양 배지를 추가하고 3일마다 교체해야 합니다.
      1. 양성대조군의 경우, TGF-β1이 첨가된 시판되는 hMSC 연골성 배지를 사용한다. 이 추가 TGF-β1은 TGF-β1 및 J/T/M JBNm 그룹 모두의 양과 동일하다.
      2. 음성 대조군 중 하나의 경우, TGF-β1을 포함하지 않는 상업용 hMSC 연골 배지를 사용하십시오. 다른 음성 대조군의 경우, 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM 세포 배양 배지를 사용한다.
      3. 다른 모든 그룹의 경우 TGF-β1이 없는 상업용 hMSC 연골성 세포 배양 배지를 사용하십시오.
    3. 샘플을 15일 동안 배양한다.
    4. 샘플의 RNA를 추출하고 PCR을 수행하여 앞서 설명한 대로 샘플의 분화를 연구합니다26.
  5. X형 콜라겐 발현 분석을 위한 면역염색
    1. 상기와 동일한 방법으로 분화된 7개의 아가로오스계 시료를 PCR 방법으로 PCR 방법으로 준비한다(단계 7.4).
    2. 샘플을 15일 동안 배양한다.
    3. 샘플을 4% 포름알데히드로 1일 동안 고정하고 30% 자당 용액에 밤새 담근 다음 액체 질소로 -80°C에서 밤새 동결합니다. 수용성 글리콜과 수지의 혼합물인 최적의 절단 온도 복합 시약(OCT)을 사용하여 -10°C에서 샘플을 고정합니다.
    4. 저온 유지 장치 마이크로톰을 작동하여 각 샘플의 20μm 두께의 냉동 섹션을 얻습니다.
    5. 제조업체의 프로토콜에 따라 1:800 희석된 항콜라겐 X 항체와 PBS로 희석된 형광 표지 2차 항체로 각 섹션을 염색합니다.
    6. 접안렌즈에서 488nm의 여기와 40x의 배율을 사용하여 컨포칼 현미경으로 각 섹션을 관찰합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜에 따라 JBNts는 UV-Vis 흡수 및 TEM으로 성공적으로 합성되고 특성화되었습니다. JBNm은 빠른 생체 모방 과정을 거치는 주사 가능한 고체 스캐폴드입니다. 생리학적 환경에서 TGF-β1/matrilin-3 용액의 혼합물에 JBNts를 첨가한 후, 그림 1에서 볼 수 있듯이 JBNm의 성공적인 조립을 나타내는 단단한 흰색 메쉬 스캐폴드가 형성되었습니다. 이것은 특성화 방법에서 입증되었습니다.

생리 학적 조건 하에서, matrilin-3은 등전점27 (그림 2A)로 인해 음전하를 띤다. TGF-β1 용액을 매트린-3 용액에 첨가한 후, TGF-β1/매트릴린-3 화합물의 제타-전위는 거의 중성 값으로 증가하여 두 단백질이 전하 상호작용을 통해 결합되었음을 나타냅니다.

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토론

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이 연구의 목표는 세포 분화를 매개하기 위해 세포 배양 환경에 의존하는 기존 조직 구축물의 한계를 극복하기 위해 생체 모방 스캐폴드 플랫폼인 JBNm을 개발하는 것입니다. JBNm은 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조 스캐폴드입니다. 혁신적인 디자인은 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노 물질인 JBNts를 기반으로 합니다. JBNts30, TGF-β1 및 matrilin-3으로 구성된 JBNm은 스캐폴드의 자체 조립이 분자 수준에서 제어되는 새로운 층별 기술을 통해 조립됩니다. JBNm의 조립을 관찰하고 제타 전위 측정, UV-Vis 흡수, TEM 및 형광 스펙트럼 분석으로 특성화했습니다.

그림 2B(3단계)의 UV-Vis 스펙트럼은 JBNm의 계층적 층별 내부 형성을 입증했습니다. 흡광도 피크의 차이는 결합 친화도의 차이로 인해 관찰될 수 있습니다. JBNts와 TG...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yupeng Chen 박사는 Eascra Biotech, Inc. 및 NanoDe Therapeutics, Inc.의 공동 설립자입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 NIH 보조금 7R01AR072027 및 7R03AR069383, NSF 경력 상 1905785, NSF 2025362 및 코네티컷 대학교의 지원을 받습니다. 이 작업은 NIH 보조금 S10OD016435에 의해 부분적으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% Normal Goat SerumThermo Fisher50062ZAgent는 염색 중 비특이적 항체 결합 작용을 차단하는 데 사용됩니다.
24웰 플레이트Corning07-200-740비교 세포 배양에 사용되는 24웰 플레이트.
384웰 블랙 미처리 플레이트Thermo Fisher262260흡수 측정에 사용되는 384웰 플레이트.
8웰 챔버 커버글라스Thermo Fisher155409PK비교 세포 배양에 사용되는 8웰 커버글라스.
96웰 플랫 바텀Corning07-200-91비교 세포 배양에 사용되는 96웰 플레이트.
96웰 플레이트: 무처리된Thermo Fisher260895비교 세포 배양 및 분석에 사용되는 96웰 플레이트.
세포 배양에 사용되는아가로스 젤시그마-알드리치A9539
아가로스 젤시그마 알드리치A9539하이드로겔은 세포 배양 환경으로 사용됩니다.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling KitThermo FisherA30006 (488) 및 A30007 (555)단백질 라벨링에 사용되는 형광 염료.
Anti-Collagen X 항체Thermo Fisher41-9771-82collagen-X를 염색하는 데 사용되는 항체.
Bio-Rad PCR 기계샘플에서 PCR을 수행하는 데 사용되는Bio-Rad
C28/I2 연골세포 세포는 다양한 샘플의 증식 능력을 분석하는 데 사용됩니다.
세포 계수 키트 8Milipore Sigma96992세포 증식 분석.
Cell ProfilerBroad Institute세포 이미지를 분석하는 데 사용되는 소프트웨어입니다.
저온 유지 장치 마이크로톰장비는 염색 및 현미경 검사에 사용하기 위해 샘플의 얇은 세그먼트를 생산하는 데 사용됩니다.
DAPIInvitrogenD1306아데닌-티민 DNA 영역에 결합하는 파란색 형광 염색제.
일회용 큐벳FISHER Scientific14-955-128분광 광도계에 사용되는 용기.
DMEM 세포 배양 배지Thermo Fisher10566032세포 성장을 지원하는 데 사용되는 배지.
소 태아 혈청GIBCOA4766801세포 성장을 지원하기 위해 세포 배양 배지에 사용되는 혈청.
Fluoromount-G 마운팅 매체Thermo Fisher00-4958-02면역 염색을 위한 슬라이드 장착에 사용되는 솔루션.
포름알데히드화합물: 마이크로톰 촬영 전에 시료를 고정하는 데 사용됩니다.
염소 항토끼 IgG (H+L) 고고도 교차 흡착 2차 항체Thermo FisherA16110단백질 염색에 사용되는 항체.
인간 중간엽 줄기세포LONZAPT-2501세포는 다양한 샘플의 차별화 능력을 분석하는 데 사용됩니다.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic MediumLONZAPT-3003연골 생성 분화를 촉진하는 데 사용되는 세포 배지.
ImageJNational Institutes of Health과 함께 사용되는 이미지 분석 소프트웨어.
itaq Universal SYBR Green One-Step KitBioRad1725150PCR에 사용되는 키트.
Janus-base nanotubes (JBNts)세포 비계 도구 역할을 하기 위해 합성 핵염기로 만든 나노튜브.
LaB6 20-120 kV 투과 전자 현미경Tecnai샘플에 대한 투과 전자 현미경을 수행하는 데 사용되는 장비.
MATLABMathWorks모델링 및 데이터 분석에 사용되는 통계 소프트웨어입니다.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050연골 세포의 접착 부위로 사용되는 구조 단백질.
NanoDrop 분광 광도계Thermo Fisher장비는 시료의 흡수 값을 측정하는 데 사용됩니다.
니콘 A1R 스펙트럼 컨포칼 현미경니콘A1R HD25컨포칼 현미경은 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.
Number 1.5 Chamber CoverglassThermo Fisher152250멸균 세포 배양 및 이미징을 위한 환경.
최적 절단 온도 화합물 시약화합물: 마이크로토밍 전에 세포를 내장하는 데 사용되는 화합물.
파라포름알데히드Thermo ScientificAAJ19943K2세포를 고정하는 데 사용되는 화합물.
PDC-32G 플라즈마 클리너Harrick 플라즈마클리너는 투과 전자 현미경 전에 그리드를 준비하는 데 사용됩니다.
페니실린-스트렙토마이신GIBCO15-140-148세포 배양 중 박테리아 성장을 억제하는 데 사용되는 항생제.
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher10010023용액은 세포 배지를 세척하고 실험 중에 완충액 역할을 하는 데 사용됩니다.
로다민-팔로이딘InvitrogenR415F-Actin 적색 형광 염료.
추출 중 검체를 필터링하고 균질화하는 데 사용되는QIAGEN74904Rneasy Plant Mini Kit
Sucrose Solution마이크로톰 처리 전에 샘플을 처리하는 데 사용되는 용액입니다.
TGF beta-1 Human ELISA KitInvitrogenBMS249-4TGF-&beta의 존재를 확인하는 데 사용되는 분석 키트; 샘플에서 1.
TGF-&베타; 1PEPROTECH100-21C연골 형성 분화 및 증식 자극에 사용되는 성장 인자.
Triton-XInvitrogenHFH10화합물은 염색 과정에서 고정되지 않은 세포를 용해하는 데 사용됩니다.
TRIzol 시약Thermo Fisher15596026RNA를 분리하는 데 사용되는 시약.
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalytical장비는 시료의 제타 전위 값을 측정하는 데 사용됩니다.
하이드로겔. 장비.현미경RNA Kit, .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106(2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317(2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590(2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50(2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823(2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676(2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670(2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147(2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155(2021).

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