연골 재생을 촉진하기 위한 층별 야누스 베이스 나노매트릭스의 제작 및 특성 분석

요약

이 프로토콜은 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)을 순차적으로 추가하여 층별 야누스 염기 나노 매트릭스 (JBNm) 스캐 폴드의 조립을 설명합니다. JBNm은 제작되고 특성화되었습니다. 또한 우수한 생리활성을 나타내어 부착, 증식 및 분화와 같은 세포 기능을 촉진했습니다.

초록

다양한 생체 재료 스캐폴드는 시험관내 및 생체 내 사용을 위한 특정 기능을 촉진하기 위해 세포 부착 및 증식을 안내하기 위해 개발되었습니다. 이러한 생체 재료 스캐폴드 내로의 성장 인자의 첨가는 일반적으로 최적의 세포 배양 환경을 제공하고, 세포 분화 및 그 후속 기능을 매개하기 위해 수행된다. 그러나, 종래의 생체 재료 스캐폴드 내의 성장 인자는 전형적으로 이식시 방출되도록 설계되어, 주변 조직 또는 세포에 의도하지 않은 부작용을 초래할 수 있다. 여기에서 DNA에서 영감을 받은 야누스 염기 나노매트릭스(JBNm)는 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조로 고도로 국소화된 미세 환경을 성공적으로 달성했습니다. JBNms는 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 생체 친화도를 통해 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)에서 자체 조립됩니다. JBNm은 TGF-β1:matrilin-3:JBNt 비율이 1:4:10으로 조립되었는데, 이는 층별 구조로의 적절한 조립이 발생할 수 있는 결정된 비율이기 때문입니다. 먼저, TGF-β1 용액을 마트릴린-3 용액에 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 JBNt 용액의 첨가 전에 충분한 균질성을 보장하기 위해 수회 피펫팅하였다. 이것은 여러 번 다시 피펫팅한 후 층별 JBNm을 형성했습니다. 층별 JBNm 구조, JBNt 단독, 마트릴린-3 단독, 및 TGF-β1 단독을 특성화하기 위해 다양한 실험을 수행하였다. JBNm의 형성은 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로 연구되었고, JBNm의 구조는 투과 전자 현미경 (TEM)으로 관찰되었습니다. 혁신적인 층별 JBNm 스캐폴드가 분자 규모로 형성됨에 따라 형광 염료 표지 JBNm을 관찰할 수 있었습니다. TGF-β1은 주사 가능한 JBNm의 내부 층 내에 국한되어 주변 부위로의 성장 인자 방출을 방지하고 국소 연골 생성을 촉진하며 항 비대 미세 환경을 촉진 할 수 있습니다.

서론

조직 공학의 스캐폴드는 세포 부착 및 후속^{조직 발달을} 위한 구조적 지지를 제공하는 데 중요한 역할을 합니다1. 전형적으로, 어떠한 스캐폴딩도 없는 종래의 조직 구축물은 세포 배양 환경에 의존하고 세포 분화를 매개하기 위해 추가된 성장 인자에 의존한다. 또한, 스캐폴드에 생리활성 분자를 추가하는 것은 종종 세포 분화 및 기능 ^2,3을 안내하는 데 선호되는 접근 방식입니다. 일부 스캐폴드는 네이티브 조직의 생화학적 미세 환경을 독립적으로 모방할 수 있는 반면, 다른 스캐폴드는 성장 인자를 통해 세포 기능에 직접 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 연구자들은 종종 세포 부착, 성장 및 분화에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 스캐폴드를 선택하는 데 어려움을 겪는 동시에^{장기간에 걸쳐} 최적의 구조적 지지와 안정성을 제공합니다^4,5. 생리 활성 분자는 종종 스캐폴드에 느슨하게 결합되어 이식시 이러한 단백질이 빠르게 방출되어 원치 않는 위치에서 방출됩니다. 이것은 의도적으로 표적화되지 않은 조직이나 세포에 대한 부작용으로 절정에 달합니다

프로토콜

1. JBNts의 합성

1. 다양한 화합물¹²의 합성을 수반하는 이전에 공개된 방법을 활용하여 JBNt 단량체를 제조한다.
2. 조 JBNt 단량체가 합성된 후 역상 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제합니다. 용매 A : 100 % 물, 용매 B : 100 % 아세토 니트릴 및 용매 C : pH = 1의 HCl 수용액을 사용하십시오. 3mL/분의 유속을 사용하십시오. HPLC에서 얻은 가장 큰 피크를 7.2분에 수집한다.

2. JBNt / Matn1 / TGF-β1 제작 (비디오 1)

알림: 비디오 1 은 JBNm이 생리적 환경(수용액, 자외선 없음, 화학 첨가물 없음 및 가열 없음)에서 형성된 주사 가능한 고체임을 보여주며, 이는 생물학적으로도 영감을 받았습니다.

1. H₂O에 현탁 된 1 mg / mL TGF-β1 8 μL를 H₂O에 현탁 된 1 mg / mL matrilin-3 3 32 μL에 첨가하여 이러한 단백질의 적절한 혼합을 보장합니다.<....

결과

프로토콜에 따라 JBNts는 UV-Vis 흡수 및 TEM으로 성공적으로 합성되고 특성화되었습니다. JBNm은 빠른 생체 모방 과정을 거치는 주사 가능한 고체 스캐폴드입니다. 생리학적 환경에서 TGF-β1/matrilin-3 용액의 혼합물에 JBNts를 첨가한 후, 그림 1에서 볼 수 있듯이 JBNm의 성공적인 조립을 나타내는 단단한 흰색 메쉬 스캐폴드가 형성되었습니다. 이것은 특성화 방법에서 입증되었습니다.

생리 학적 조건 하에서, matrilin-3은 등전점²⁷ (그림 2A)로 인해 음전하를 띤다. TGF-β1 용액을 매트린-3 용액에 첨가한 후, TGF-β1/매트릴린-3 화합물의 제타-전위는 거의 중성 값으로 증가하여 두 단백질이 전하 상호작용을 통해 결합되었음을 나타냅니다.

토론

이 연구의 목표는 세포 분화를 매개하기 위해 세포 배양 환경에 의존하는 기존 조직 구축물의 한계를 극복하기 위해 생체 모방 스캐폴드 플랫폼인 JBNm을 개발하는 것입니다. JBNm은 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조 스캐폴드입니다. 혁신적인 디자인은 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노 물질인 JBNts를 기반으로 합니다. JBNts³⁰, TGF-β1 및 matrilin-3으로 구성된 JBNm은 스캐폴드의 자체 조립이 분자 수준에서 제어되는 새로운 층별 기술을 통해 조립됩니다. JBNm의 조립을 관찰하고 제타 전위 측정, UV-Vis 흡수, TEM 및 형광 스펙트럼 분석으로 특성화했습니다.

그림 2B(3단계)의 UV-Vis 스펙트럼은 JBNm의 계층적 층별 내부 형성을 입증했습니다. 흡광도 피크의 차이는 결합 친화도의 차이로 인해 관찰될 수 있습니다. JBNts와 TG.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10% Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent는 염색 중 비특이적 항체 결합 작용을 차단하는 데 사용됩니다.
24웰 플레이트	Corning	07-200-740	비교 세포 배양에 사용되는 24웰 플레이트.
384웰 블랙 미처리 플레이트	Thermo Fisher	262260	흡수 측정에 사용되는 384웰 플레이트.
8웰 챔버 커버글라스	Thermo Fisher	155409PK	비교 세포 배양에 사용되는 8웰 커버글라스.
96웰 플랫 바텀	Corning	07-200-91	비교 세포 배양에 사용되는 96웰 플레이트.
96웰 플레이트: 무처리된	Thermo Fisher	260895	비교 세포 배양 및 분석에 사용되는 96웰 플레이트.
세포 배양에 사용되는	아가로스 젤	시그마-알드리치	A9539
아가로스 젤	시그마 알드리치	A9539	하이드로겔은 세포 배양 환경으로 사용됩니다.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) 및 A30007 (555)	단백질 라벨링에 사용되는 형광 염료.
Anti-Collagen X 항체	Thermo Fisher	41-9771-82	collagen-X를 염색하는 데 사용되는 항체.
Bio-Rad PCR 기계	샘플에서 PCR을 수행하는 데 사용되는	Bio-Rad
C28/I2 연골세포 세포			는 다양한 샘플의 증식 능력을 분석하는 데 사용됩니다.
세포 계수 키트 8	Milipore Sigma	96992	세포 증식 분석.
Cell Profiler	Broad Institute		세포 이미지를 분석하는 데 사용되는 소프트웨어입니다.
저온 유지 장치 마이크로톰			장비는 염색 및 현미경 검사에 사용하기 위해 샘플의 얇은 세그먼트를 생산하는 데 사용됩니다.
DAPI	Invitrogen	D1306	아데닌-티민 DNA 영역에 결합하는 파란색 형광 염색제.
일회용 큐벳	FISHER Scientific	14-955-128	분광 광도계에 사용되는 용기.
DMEM 세포 배양 배지	Thermo Fisher	10566032	세포 성장을 지원하는 데 사용되는 배지.
소 태아 혈청	GIBCO	A4766801	세포 성장을 지원하기 위해 세포 배양 배지에 사용되는 혈청.
Fluoromount-G 마운팅 매체	Thermo Fisher	00-4958-02	면역 염색을 위한 슬라이드 장착에 사용되는 솔루션.
포름알데히드			화합물: 마이크로톰 촬영 전에 시료를 고정하는 데 사용됩니다.
염소 항토끼 IgG (H+L) 고고도 교차 흡착 2차 항체	Thermo Fisher	A16110	단백질 염색에 사용되는 항체.
인간 중간엽 줄기세포	LONZA	PT-2501	세포는 다양한 샘플의 차별화 능력을 분석하는 데 사용됩니다.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	연골 생성 분화를 촉진하는 데 사용되는 세포 배지.
ImageJ	National Institutes of Health		과 함께 사용되는 이미지 분석 소프트웨어.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	PCR에 사용되는 키트.
Janus-base nanotubes (JBNts)			세포 비계 도구 역할을 하기 위해 합성 핵염기로 만든 나노튜브.
LaB6 20-120 kV 투과 전자 현미경	Tecnai		샘플에 대한 투과 전자 현미경을 수행하는 데 사용되는 장비.
MATLAB	MathWorks		모델링 및 데이터 분석에 사용되는 통계 소프트웨어입니다.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	연골 세포의 접착 부위로 사용되는 구조 단백질.
NanoDrop 분광 광도계	Thermo Fisher		장비는 시료의 흡수 값을 측정하는 데 사용됩니다.
니콘 A1R 스펙트럼 컨포칼 현미경	니콘	A1R HD25	컨포칼 현미경은 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	멸균 세포 배양 및 이미징을 위한 환경.
최적 절단 온도 화합물 시약			화합물: 마이크로토밍 전에 세포를 내장하는 데 사용되는 화합물.
파라포름알데히드	Thermo Scientific	AAJ19943K2	세포를 고정하는 데 사용되는 화합물.
PDC-32G 플라즈마 클리너	Harrick 플라즈마		클리너는 투과 전자 현미경 전에 그리드를 준비하는 데 사용됩니다.
페니실린-스트렙토마이신	GIBCO	15-140-148	세포 배양 중 박테리아 성장을 억제하는 데 사용되는 항생제.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	용액은 세포 배지를 세척하고 실험 중에 완충액 역할을 하는 데 사용됩니다.
로다민-팔로이딘	Invitrogen	R415	F-Actin 적색 형광 염료.
추출 중 검체를 필터링하고 균질화하는 데 사용되는	QIAGEN	74904	Rneasy Plant Mini Kit
Sucrose Solution			마이크로톰 처리 전에 샘플을 처리하는 데 사용되는 용액입니다.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	TGF-&beta의 존재를 확인하는 데 사용되는 분석 키트; 샘플에서 1.
TGF-&베타; 1	PEPROTECH	100-21C	연골 형성 분화 및 증식 자극에 사용되는 성장 인자.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	화합물은 염색 과정에서 고정되지 않은 세포를 용해하는 데 사용됩니다.
TRIzol 시약	Thermo Fisher	15596026	RNA를 분리하는 데 사용되는 시약.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		장비는 시료의 제타 전위 값을 측정하는 데 사용됩니다.

하이드로겔. 장비.현미경RNA Kit, .