방법 논문

CUBIC 전체 신장 3차원 염색

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DOI:

10.3791/63986

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2022년 7월 18일

 , 
1Division of Nephrology and Endocrinology, The University of Tokyo

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 3차원(3D) 신장 영상을 위한 조직 투명화 방법 및 전체-마운트 면역형광 염색을 기술한다. 이 기술은 신장 병리학에서 거시적 관점을 제공하여 새로운 생물학적 발견으로 이어질 수 있습니다.

초록

기존의 병리학은 신장 미세 구조에 대한 많은 정보를 제공했지만 3차원(3D) 정보가 부족하여 신장의 혈관, 근위 세뇨관, 수집 관, 사구체 및 교감 신경의 정확한 구조를 알기가 어려웠습니다. 광학 클리어링은 이 큰 장애물을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 전체 장기의 여러 세포는 조직 투명화와 3D 이미징 기술을 결합하여 단일 세포 분해능으로 분석할 수 있습니다. 그러나 전체 장기 이미징을위한 세포 표지 방법은 아직 개발되지 않았습니다. 특히, 전체 장착 장기 염색은 항체 침투의 어려움 때문에 어렵습니다. 본 프로토콜은 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌 / 신체 이미징 칵테일 및 전산 분석) 조직 투명화 방법을 사용하여 3D 이미징을위한 전체 마운트 마우스 신장 염색을 개발했습니다. 이 프로토콜은 포괄적 인 관점에서 당뇨병 성 신장 질환의 초기 단계에서 허혈 재관류 손상 및 사구체 비대 후 신장 교감 신경 탈신경을 시각화 할 수있게했습니다. 따라서이 기술은 거시적 관점을 제공함으로써 신장 연구에서 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다.

서론

신장은 다양한 세포 집단으로 구성됩니다. 기존의 병리학은 신장 미세 환경에 대한 많은 정보를 제공하지만 신장 질환 진행 중 세포 간 누화를 정확하게 이해하려면 3차원(3D) 영상이 필요합니다. 과거에는 전체 장기 3D 이미징1을 위해 수많은 연속 절단 및 이미지 재구성을 수행해야 했습니다. 그러나이 방법은 너무 많은 노력이 필요하고 재현성 측면에서 문제가있었습니다.

광학 클리어링은 이 장애물 2,3을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 조직 불투명도는 각 기관이 물, 단백질 및 지질을 포함한 다양한 물질로 구성되어 있기 때문에 주로 광산란 및 흡수로 인한 것입니다. 따라서 조직 청소의 기본 전략은 조직의 물과 지질을 단백질4와 동일한 광학적 특성을 갖는 굴절률(RI) 일치 시약으로 대체하는 것입니다. 투명한 시편을 관찰하기 위해서는, 라이트 시트 형광 현미경이 유용하다5. 라이트 시트는 측면에서 투명한 시편을 비추고 여기 신호는 수직 위치6에 위치한 대물 렌즈를 통해 획득됩니다. 이 현미경은 단일 스윕으로 단면 정보를 얻으며, 이는 컨포칼 또는 다광자 형광 현미경과 다릅니다. 따라서 낮은 수준의 광퇴색으로 z 스택 이미지를 빠르게 획득할 수 있습니다.

투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 영상 칵테일 및 전산 분석(CUBIC)은 광학 시트 형광 현미경 2,7,8로 전체 장기 이미징을 가능하게 하는 조직 투명화 방법 중 하나입니다. CUBIC 및 전체 장착 면역형광 염색은 마우스 신장 3D 구조 9,10,11을 시각화하기 위해 본 연구에서 최적화되었습니다. 이 전체 장착 염색 방법을 사용하여 허혈 재관류 손상 9,10 및 당뇨병 성 신장 질환 11의 초기 단계의 사구체 비대뿐만 아니라 혈관, 근위 세뇨관 및 전체 신장 9의 수집 덕트 후에 신장 교감 신경의 변화를 시각화합니다.

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프로토콜

모든 실험은 도쿄 대학 기관 검토위원회의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 지침에 따라 수행되었습니다. 8주령의 수컷 C57BL/6NJcl 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조).

1. 동물 준비 및 신장 고정

  1. 아래 단계에 따라 관류 고정을 수행하십시오.
    1. 이소플루란(3%, 2.0L/min)을 흡입하고 메데토미딘 염산염(0.3mg/kg), 부토르파놀 타르트레이트(5mg/kg) 및 미다졸람(4mg/kg)을 복강내 투여하여 마우스를 마취시킵니다( 재료 표 참조).
    2. 동물을 20mL의 PBS(pH 7.4) 및 30mL의 4% PFA로 인산염 완충액(PB)으로 관류시킨다(12).
  2. 관류 고정 직후 침지 고정을 수행하고 신장 샘플링9.
    1. 신장을 4°C에서 4% PFA에 16시간 더 담근 다음 PBS로 2시간(3회)9 동안 세척합니다(그림 1).
      주의 : 포름 알데히드와 파라 포름 알데히드는 독성 자극제입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 흄 후드에서 시약을 취급하십시오.

2. 탈색 및 탈색

  1. 이전에 발표 된 보고서 4,8,9에 따라 10wt %의 Triton X-100과 10wt %의 N- 부틸 디 에탄올 아민 (재료 표 참조)으로 구성된 탈색 및 탈색을 위해 CUBIC-L을 준비하십시오.
  2. 아래 단계에 따라 CUBIC-L에 의한 탈색 및 탈색을 수행하십시오.
    1. 고정된 신장을 14mL 둥근 바닥 튜브(재료 표 참조)에 넣고 7mL의 50%(v/v) CUBIC-L(물과 CUBIC-L의 1:1 혼합물)에 담그고 실온에서 6시간 동안 부드럽게 흔듭니다(그림 2A). 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-L에 담그고 37°C에서 5일 동안 부드럽게 흔듭니다.
    2. 이 과정에서 매일 CUBIC-L을 새로 고칩니다. 탈색 및 탈색 과정 후 실온에서 PBS로 신장을 2시간(3회)9 세척합니다(그림 1). 시료 취급을 위해 분주 스푼을 사용하십시오(그림 2B).

3. 전체 마운트 면역 형광 염색

  1. 염색 완충액을 준비한다.
    1. PBS에 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.5% 카제인, 0.05% 아지드화나트륨9를 혼합하여 1차 항체용 염색 완충액을 준비합니다.
    2. PBS에 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.1% 카제인, 0.05% 아지드화나트륨9를 혼합하여 2차 항체용 염색 완충액을 준비합니다.
  2. 1 차 항체로 염색을 수행하십시오.
    1. 37°C에서 염색 완충액에서 1차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 지질된 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다.
      참고: 한 신장에 필요한 염색 완충액의 양은 500-600 μL입니다(그림 2C).
    2. 신장을 PBS(PBST)의 0.5%(v/v) 트리톤 X-100으로 실온에서1일 동안 세척합니다(그림 1).
  3. 2 차 항체로 염색을 수행하십시오.
    1. 37°C에서 염색 완충액에서 2차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다. 실온에서 PBST로 신장을1일 동안 세척합니다(그림 1).
    2. 고정후 9, 신장을 PB의 1% 포름알데히드(37% 포름알데히드와 PB의 혼합물 1:36)에 3시간 동안 담그고 실온에서 PBS로 6시간 동안 세척합니다(그림 1).

4. 굴절률 (RI) 일치

  1. 큐빅-R+를 준비합니다.
    1. 45wt%의 2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론/안티피린과 30wt%의 니코틴아미드를 혼합하여 CUBIC-R을 준비합니다( 재료 표 참조).
    2. 이전에 발표 된 보고서 4,8,9에 따라 CUBIC-R에 N- 부틸 디 에탄올 아민 0.5 v%를 추가하여 굴절률 (RI) 일치를 위해 CUBIC-R +를 준비합니다.
  2. RI 일치를 수행합니다.
    1. 신장을 14mL 둥근 바닥 튜브에 넣고 14mL 둥근 바닥 튜브에 50%(v/v) CUBIC-R+(물과 CUBIC-R+의 1:1 혼합물) 7mL에 담그고 실온에서 1일 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-R+를 담그고 실온에서2일 동안 부드럽게 흔들어 9(그림 1).
      참고: 신장은 RI 매칭이 시작될 때 50% CUBIC-R+에 떠 있지만 프로세스가 끝나면 CUBIC-R+에서 가라앉고 투명해집니다(그림 2D).

5. 이미지 획득 및 재구성

  1. 이미지 획득 중에 RI 매칭 신장을 실리콘 오일(RI = 1.555)과 미네랄 오일(RI = 1.467)(55:45)의 혼합물에 담그십시오(RI = 1.51)5 (그림 3).
  2. 맞춤형9 라이트 시트 형광 현미경으로 전체 신장의 3D 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조). 모든 원시 이미지 데이터를 16비트 TIFF 형식으로 수집합니다. 이미징 분석 소프트웨어로 3D 렌더링 이미지를 시각화하고 캡처합니다(Imaris, 재료 표 참조).

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결과

이 염색 방법을 사용하여 전체 신장 (그림 4A, B 및 비디오 1)의 교감 신경 [항 티로신 하이드 록 실라 제 (TH) 항체] 및 동맥 [항 α 평활근 액틴 (αSMA) 항체]을 시각화했습니다9. 비정상적인 신장 교감 신경은 허혈 / 재관류 손상 (IRI) 9,10 후에 시각화되었습니다 (그림 4C). 더욱이, 전체 비장(13)에서 교감신경 시각화는 이 프로토콜을 사용하여 달성되었다(도 4D). 3D 면역형광 데이터를 정량화하는 한 가지 예가 도 5에 도시되어 있다....

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토론

본 프로토콜은 교감 신경, 수집 관, 동맥, 근위 세뇨관 및 사구체 9,10,11과 같은 다양한 구조의 전체 신장 3D 이미징을 허용했습니다. 이 염색 방법은 거시적 관찰을 제공하고 허혈 재관류 손상 9,10 후 신장 교감 신경의 변화와 당뇨병 신장 질환 11의 초기 단계에서 사구체 비대를 시각화함으로써 새로운 생물학적 발견으로 이어졌습니다.

혼탁은 조직5의 광학적 불균일성으로부터 유도된다. 다양한 조직 투명화 방법의 공통 원리는 광산란자/흡수체를 제거하고 RI 일치 시약으로 공간을 채우는 것입니다. 용매 제거 장기의 3D 이...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구의 일부는 우에다 히로키 교수(도쿄대학), 스사키 에츠오 A. 교수(준텐도 대학), 다나카 테츠히로 교수(도호쿠 대학), 후카가와 마사후미 교수, 와다 타케히코 박사, 고마바 히로타카 박사(도카이 대학)와의 협력을 통해 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
14mL 둥근 바닥 고선명도 PP 시험관Falcon352059조직 투명화, 염색, 세척
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrineTokyo ChemicalIndustry D1876CUBIC-R+
37%-포름알데히드 용액Nacalai Tesque16223-55고정 후
4%-파라포름알데히드 인산염 완충 용액Nacalai Tesque09154-85신장 고정,
Alexa Flour, 555-conjugated donkey, anti-sheep, IgG 항체InvitrogenA-214362차 항체 (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey, anti-rabbit, IgG 항체InvitrogenA-315732차 항체 (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2), 항체Abcamab1999751차 항체 (1:100)
Anti-podocin 항체Sigma-AldrichP03721차 항체 (1:100)
항나트륨 포도당 공동수송체 2 (SGLT2) 항체Abcamab856261차 항체 (1:100)
항티로신 하이드록실라제(TH) 항체Abcamab1131차 항체 (1:100)
항-알파;-평활근 액틴(&알파;-SMA) 항체Abcamab56941차 항체 (1:200)
PBS의 차단제 카제인Thermo Fisher Scientific37528염색 완충액
부토르파놀 주석산염Meiji005526마취제
C57BL/6NJclNippon Bio-Supp.CenterN/A마우스 균주
ImarisBitplaneN/A이미징 분석 소프트웨어
매크로 줌 현미경OLYMPUSMVX10관측 장치 맞춤형 현미경
Medetomidine HydrochlorideKyoritsu-Seiyaku008656마취제
MidazolamSANDOZ27803229마취
미네랄 오일Sigma-AldrichM8410침지 오일
N-부틸디에탄올아민도쿄 화학 공업B0725CUBIC-L, CUBIC-R+
니코틴아미드도쿄 화학 산업N0078CUBIC-R +
폴리에틸렌 글리콜 모노 -p- 이소 옥틸 페닐 에테르 / 트리톤 X-100Nacalai Tesque12967-45CUBIC-L, PBST
실리콘 오일 HIVAC-F4Shin-Etsu 화학50449832침지 오일
Wako195-11092염색 완충액
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참고문헌

  1. Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  4. Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  5. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  9. Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
  10. Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
  11. Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  17. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).

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