레이저 포획 미세 해부와 미세 유체 RT-qPCR의 조합은 단일 뉴런 및 아교 세포에서 전사체를 측정 할 때 해부학 적 및 생물 공학적 특이성을 제공합니다. 정신 질환에 대한 시스템의 생물학적 접근 방식으로 창의적인 방법을 적용하면 중독에 대한 신경 염증 보상 가설과 같은 이해와 치료의 돌파구로 이어질 수 있습니다.
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방법 논문
해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
중독 행동의 증가율은 정신 건강 연구자와 임상의 모두가 안티 보상과 회복을 이해하도록 동기를 부여했습니다. 보상과 시작에서 벗어나는 이러한 전환은 중독을 조사하는 데 적용되는 방법의 확장과 함께 새로운 관점, 패러다임 및 가설을 필요로합니다. 여기에서는 레이저 포획 미세 해부(LCM)와 고처리량 미세유체 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 결합한 안티보상을 조사하기 위한 시스템 생물학 접근 방식을 제공합니다. 유전자 발현 네트워크 역학을 측정하고 알코올 및 오피오이드 금단에서 신경 내장 조절 장애의 주요 동인인 신경 염증을 확인했습니다. 이러한 기술의 조합은 높은 처리량 감도 및 특정 유전자 발현 측정과 함께 단일 세포 분해능에서 해부학적 및 표현형 특이성을 제공하여 가설 생성 데이터 세트와 새로운 통찰력 및 치료 기회를 생성하는 기계론적 가능성을 모두 제공합니다.
서론
중독은 선진국에서 여전히 증가하는 도전으로 남아 있습니다 1,2. 주요 과학 및 임상 발전에도 불구하고 중독률은 계속 증가하는 반면 기존 치료법의 효능은 기껏해야 안정적으로 유지됩니다 3,4,5. 그러나 생명 공학과 과학적 접근의 발전으로 물질 의존의 병태 생리학을 추가로 조사하기위한 새로운 방법과 가설이 생겨났습니다 6,7,8. 실제로, 최근의 발전은 새로운 개념과 치료 패러다임이 사회적, 경제적, 정치적 결과를 가져 오는 돌파구로 이어질 수 있음을 시사합니다 9,10,11,12.
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프로토콜
이 연구는 토마스 제퍼슨 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 권고에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 Thomas Jefferson University IACUC의 승인을 받았습니다.
1. 동물 모델
- 하우스 수컷 Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) 쥐 세 쌍둥이는 에탄올 차우 (2 마리) 또는 대조군 차우 혼합물 (1 쥐)에 자유롭게 접근 할 수 있습니다.
참고 :이 대표적인 실험은 알코올 금단25,26의 신경 생물학을 연구하기 위해 Lieber-DeCarli 프로토콜을 사용했습니다. 쥐 세 쌍둥이는 동일한 수의 칼로리를 섭취하는 3 마리의 쥐 코호트로 구성되지만 희생시 연구의 다른 팔에 들어갑니다. 이 연구의 세 가지 부문은 1) 대조군, 2) 에탄올 의존성 (EtOH) 및 3) 철수 (Wd)입니다 (그림 1A). 이 연구에는 3 개의 알코올 금단 시점이 있으므로 총 5 가지 조건이 있습니다 (그림 1A....
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결과
단일 셀 수집의 검증은 LCM 절차 중에 시각적으로 수행됩니다. 세포핵은 QC 스테이션에서 평가됩니다. 세포 유형은 그 세포 유형 및 그의 일반적인 형태에 대한 태그된 형광단의 방출에 의해 결정될 수 있다. 캡에서 원하지 않는 세포가 선택되면 QC 스테이션에서 UV 레이저로 유전 물질을 파괴 할 수 있습니다. 분자 분석을 통한 추가 검증도 필요합니다. 이 대표적인 실시예16에서, 미세아교세포 이외에 티로신 하이드록실라제(Th) 양성(+) 및 Th 음성(-)의 두 가지 유형의 뉴런이 선택되었다. 도 1D 는 뉴런이 되도록 의도된 샘플이 뉴런 마커인 NeuN 의 통계적으로 유의한 상승된 발현을 입증했음을 입증한다. 동시에, 미세아교세포 샘플은 미세아교세포 마커인 CD34 및 Cx3xr1 의 상당한 상승을 가졌으며, 이는 샘플 선택이 높은 충실도로 수행되었음을 시사합니다. 또한, Th+ 뉴런.......
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토론
알코올 사용 장애는 치료하기 어려운 질병으로 남아 있습니다. 우리 그룹은 시스템 신경 과학적 관점에서 보상 방지 과정을 조사함으로써이 장애에 접근했습니다. 우리는 알코올 금단 시계열16에서 단일 NTS 뉴런과 미세아교세포의 유전자 발현 변화를 측정했습니다. NTS는 알코올 금단 증후군에서 발생하는 자율 조절 장애에서 두드러진 역할을 위해 선택되었습니다. 자사는 LCM을 단일 세포 미세유체 RT-qPCR과 결합하여 해부학적 및 분자 민감도와 특이성으로 저렴한 비용으로 강력한 수의 샘플과 유전자를 측정할 수 있습니다(그림 1B-C). 단일-세포를 IHC 염색에 의해 확인 및 선택하고, 이들 세포 서브페노타입 그룹을 분자 발현으로 검증하였다 (도 1D-E). 그러나,.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
여기에 제시된 작업은 JS 및 RV에 수여 된 NIH HLB U01 HL133360, JS 및 EVB에 수여 된 NIDA R21 DA036372, SJO 'S를 지원하기 위해 Jan Hoek에게 수여 된 T32 AA-007463 및 국립 알코올 중독 및 알코올 남용 연구소 : R01 AA018873을 통해 자금을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 20X DNA 결합 염료 | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE 분석 로딩 시약 | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 유전자 발현을 위한 동적 어레이 IFC (텍스트에서는 qPCR 칩이라고 함) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β 항체 | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN 항체, 클론 A60 | EMD Millipore | MAB377 | 신경 염색 |
| 항 티로신 하이드록실라제 항체 | abcam | ab112 | TH+ 뉴런 용 염색 |
| ArcturusXT 레이저 캡처 미세 해부 시스템 | Arcturus | NA | |
| NA Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR 플랫폼 |
| 소 혈청 항원 | 시그마-알드리치 | B4287 | |
| CapSure 매크로 LCM 캡 | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect 원스텝 qRT-PCR 키트 | ThermoFisher Scientific | 11753500 | 용해 완충액 용액 구성 요소 |
| CellsDirect Resuspension & 용해 버퍼 키트 | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | , ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA, 현탁액 버퍼 | , TEKnova | T0221 | |
| 당나귀 anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe 2차 항체, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), ReadyProbe, 2차 항체, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry 항체 |
| 엑소뉴클레아제 I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure 샘플 추출 장치 | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | 일반 유리 슬라이드 |
| GeneAmp 얇은 벽 반응관 | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| 염소 안티 마우스 IgG (H + L), Superclona 재조합 2 차 항체, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry 항체 |
| IFC 컨트롤러 | Fluidigm | NA | |
| NA RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA 합성 키트 | ThermoFisher Scientific | 11754250 | 포함 VILO 및 SuperScript |
| T4 유전자 32 단백질 | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan 프리앰프, 마스터 믹스 | ThermoFisher Scientific 4391128 | NA | |
| TE 버퍼 | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-skirted 96-Well PCR 플레이트, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
참고문헌
- Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence.
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