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방법 논문

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

4.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64026

⸱

2022년 8월 25일

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

이 논문에서

요약

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

초록

세포의 주요 기계 기계 인 액틴 세포 골격은 세포 변형, 분열, 이동 및 부착을 포함한 수많은 필수적인 물리적 세포 활동을 매개합니다. 그러나, 생체내에서 액틴 네트워크의 역학 및 구조를 연구하는 것은 살아있는 세포 내의 생화학적 및 유전적 조절에 의해 복잡하다. 세포 내 생화학 적 조절이없는 최소한의 모델을 구축하기 위해 액틴은 거대한 unilamellar vesicles (GUV, 리포솜이라고도 함) 내부에 캡슐화됩니다. 생체모방 리포솜은 세포 크기이며 세포 골격 네트워크의 기계적 및 동적 특성에 대한 정량적 통찰력을 촉진하여 상향식 합성 생물학을위한 실행 가능한 경로를 열어줍니다. 캡슐화를 위해 리포솜을 생성하기 위해 역전 에멀젼 방법 (에멀젼 전달 방법이라고도 함)이 사용되며, 이는 복잡한 용액을 리포솜으로 캡슐화하여 다양한 세포 모방 시스템을 제조하는 가장 성공적인 기술 중 하나입니다. 이 방법으로, 관심있는 단백질의 혼합물이 내부 완충액에 첨가되고, 이는 나중에 인지질 함유 광유 용액에서 유화되어 단층 지질 방울을 형성한다. 원하는 리포솜은 지질/오일-물 계면을 가로지르는 단층 지질 방울로부터 생성된다. 이 방법은 농축된 액틴 중합체를 원하는 지질 성분을 갖는 리포솜 내로 캡슐화할 수 있게 하여, 생체모방 세포골격 네트워크의 시험관내 재구성을 위한 길을 닦아준다.

서론

액틴 세포골격은 분자 수준의 수축성 및 힘 생성 1,2,3을 조정함으로써 세포의 세포내 구조를 구성하는데 근본적인 역할을 한다. 그 결과, 세포 변형4,5, 분열6, 이동 7,8 및 부착9를 포함하는 수많은 필수 세포 활동을 매개한다. 액틴 네트워크의 시험관내 재구성은 최근 몇 년 동안10,11,12,13,14,15,16,17에서 엄청난 주목을 받았다. 재구성의 목표는 살아있는 세포 내에 존재하는 복잡한 생화학 적 조절이없는 세포의 최소 모델을 구축하는 것입니다. 이는 특정 세포내 활동을 조사하기 위한 조절가능한 환경을 제공하고, 액틴 세포골격(18,19)의 상이한 성분들의 확인 및 분석을 용이하게 한다. 또한, 인지질 거대 유니라멜라 소포(GUVs, 리포솜) 내부의 시험관내 액틴 네트워크의 캡슐화는 반투과성 경계를 갖는 한정된 그러나 변형가능한 공간을 제공한다. 그것은 세포 내 액틴 기계의 생리적, 기계적 미세 환경 9,20,21,22을 모방합니다.

리포솜을 제조하는 다양한 방법 중에서, 지질막 수화 방법(팽윤 방법이라고도 함)은 가장 초기의 기술(23) 중 하나이다. 건조 지질 필름은 완충제를 첨가하여 수화되어 막강한 기포를 형성하여 결국 소포(24)가됩니다. 더 높은 수율로 더 큰 소포를 생산하기 위해, 전기 형성 방법(25)으로 알려진 필름 수화 방법으로부터 발전하는 개선된 방법은 AC 전기장을 적용하여 수화 공정(26)을 효율적으로 촉진시킨다. 액틴 캡슐화를 위한 이러한 수화-기반 방법의 주요 한계는 고농축 단백질의 낮은 캡슐화 효율을 가지며, 단지 특정 지질 조성물(24)과 양립가능하다는 것이다. 이에 비해 반전된 에멀젼 기술은 지질 성분 및 단백질 농도 20,27,28,29에 대한 제한이 적습니다. 이 방법에서, 캡슐화를 위한 단백질의 혼합물이 내부 수성 완충액에 첨가되고, 이는 나중에 지질 함유 광유 용액에서 유화되어, 지질-단층 액적을 형성한다. 단층 지질 방울은 원심분리를 통해 다른 지질 / 오일 - 물 계면을 통과하여 이중층 지질 소포 (리포솜)를 형성합니다. 이 기술은 액틴 캡슐화24,30에 대한 가장 성공적인 전략 중 하나임이 입증되었습니다. 별개로, 펄스 분사(31,32), 과도 막 토출(33), 및 cDICE 방법(34)을 포함하는 일부 미세유체 장치 방법이 있다. 반전 에멀젼 방법과 미세 유체 방법 사이의 유사점은 사용되는 지질 용매 (오일)와 리포솜의 외부 전단지의 형성을위한 지질 / 오일 - 물 계면의 도입입니다. 대조적으로, 미세유체 방법에 의한 리포솜의 생성은 미세유체 장치의 셋업을 필요로 하고, 이중층의 두 전단지 사이에 포획된 오일을 수반하며, 이는 오일 제거(35)를 위한 추가적인 단계를 필요로 한다.

이 원고에서, 우리는 이전에22에서 사용했던 바와 같이 중합된 F-액틴 네트워크를 캡슐화하는 리포솜을 제조하기 위해 반전된 에멀젼 기술을 사용했다. 캡슐화를 위한 단백질 혼합물을 먼저 액틴을 그의 구상(G) 형태로 유지하기 위해 비중합 조건의 완충액에 넣었다. 전체 공정은 초기 액틴 중합을 방지하기 위해 4°C에서 수행되었고, 이는 나중에 샘플을 실온으로 가온하도록 허용함으로써 촉발되었다. 일단 실온에서 일단 액틴은 그의 필라멘트성 (F) 형태로 중합된다. 다양한 액틴 결합 단백질을 내부 수성 완충 용액에 첨가하여 단백질 기능 및 특성을 연구 할 수 있으므로 액틴 네트워크 및 막 표면과의 상호 작용에 대한 통찰력을 추가로 제공합니다. 이 방법은 또한 최종 리포솜(28,37)의 크기에 가까운 다양한 목적 단백질(36) 및 대형 물체(미세입자, 자기 추진식 마이크로수영 등)의 캡슐화에도 적용될 수 있다.

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프로토콜

1. 완충액 및 단백질 용액의 제조

  1. 0.1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM 다브코,320 mM 수크로오스 및 0.2 mM ATP를 혼합하여 총 부피 5 mL의 수성 내부 비중합 (INP) 완충액을 제조하였다.
  2. 단백질을 다음 농도로 4°C에서 INP 버퍼에 첨가하여 단백질 믹스(PM)를 제조하였다: 11.2 μM 비형광 G-액틴, 2.8 μM 형광 표지된 액틴, 및 0.24 μM Arp2/3 (표 of Materials). F-액틴 층을 형성하기 위해, PM에 100 nM 겔솔린, 4 μM 코필린, 및 2.2 μM VCA-His를 첨가한다. 대조군 실험으로 PM을 100 μg/mL 형광 염료로 대체하십시오 (표 of Materials).
  3. 100 mM KCl, 4 mMMgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 10 mM ATP, 및 80 mM 수크로스를 혼합하여 총 부피 5 mL의 수성 내부 중합 (IP) 완충액 (수성)을 제조하였다.
  4. INP 버퍼(PM를 함유함)와 IP 버퍼를 1:1의 부피비로 혼합하여 최종 버퍼(FB)를 준비하여 리포솜 내에 캡슐화될 총 부피 30 μL의 내부 수용액을 수득하였다.
  5. 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0.2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 212 mM 글루코스 및 0.1 mg/mL β-카제인을 혼합하여 총 부피 150 μL의 수성 외부 완충액 (OB)을 제조하였다.
    참고: OB의 삼투압은 글루코스로 조정하여 OB의 삼투압이 FB(20-60mOsm)보다 약간 더 크도록 할 수 있습니다. FB의 밀도는 OB보다 약간 높아야합니다.

2. 반전 에멀젼 기술에 기초한 리포좀의 제조

  1. 지질-오일 혼합물 제조
    1. 25mg/mL L-α-포스파티딜콜린(비형광성 에그 PC, 1% DHPE를 포함한 EPC라고도 함) 100μL를 유리 바이알에 넣습니다. 아르곤 가스로 클로로포름을 증발시켜 바이알 바닥에 건조한 고체 지질 필름 (2.5mg)을 남깁니다.
      1. F-액틴 층을 형성하기 위해, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-{[n(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세트산]숙시닐} 니켈염(DOGS-NTA-Ni)을 DOGS-NTA-Ni에 EPC의 10:1 비율로 첨가하고, 클로로포름을 증발시키기 전에 혼합한다.
    2. 미네랄 오일 2 mL를 첨가하고 지질-오일 혼합물을 실온에서 1시간 동안 욕조에서 초음파 처리하여 지질을 재현탁시킨다.
      참고: 초음파 처리 후 지질-오일 혼합물은 4°C에서 1주일 동안 유지될 수 있다. 사용하기 전에 재 초음파 처리가 권장됩니다.
  2. 관심있는 단백질을 포함하는 단층 지질 방울을 제조하기 위해 오일 (FB / 오일) 에멀젼에 최종 버퍼를 준비하십시오.
    1. 플라스틱 튜브에서 취한 지질-오일 혼합물 100 μL에 FB 10 μL를 첨가한다. FB가 하나의 물방울에 있는지 확인하십시오.
    2. 유리 주사기를 사용하여, 지질-오일-FB 혼합물을 그리고 그것을 유화시키기 위해 여러 번 위아래로 부드럽게 흡인하고; 소량의 지질-오일 혼합물을 먼저 그린 다음, 주사기의 끝을 액적의 주변에 위치시켜 FB 액적을 작은 물방울로 분해한다. 희끄무레하고 흐린 에멀젼이 형성 될 때까지 위아래로 열망을 반복하십시오.
  3. 30 μL의 OB를 별도의 플라스틱 튜브에 넣으십시오. 30 μL의 지질-오일 혼합물을 OB 상부에 놓고 계면에서 지질 단분자층을 개발하기 위해 ∼10분 동안 앉히십시오.
    참고: 지질이 충전되거나 단백질이 혼입된 경우, 이 단계의 지속 기간은38로 연장되어야 한다.
  4. 리포좀 준비
    1. 50μL의 FB/오일 에멀젼(단계 2.2)을 단계 2.3에서 튜브의 상부 오일상에 조심스럽게 첨가한다.
    2. 플라스틱 튜브를 4°C에서 15분 동안 100 x g 에서 원심분리한다. 리포좀 형성을 최적화하기 위해 시간과 원심분리 속도를 다양하게하십시오.
      참고 : 원심 분리 후 상단 유상은 명확해야하며 하단 OB (리포좀 포함)는 약간 흐려야합니다.
    3. 피펫으로 오일 상을 조심스럽게 제거하십시오. 필요한 경우 추가 볼륨을 흡인하십시오. 리포좀 상 위에 반월 상 연골이 생기지 않도록 튜브 측면에 피펫 팁을 넣지 마십시오.
    4. 새로운 피펫으로 피펫 팁을 나머지 바닥 상에 천천히 붙이고 수성 부피를 흡인하여 리포솜을 수집하십시오.
      참고 : 오일을 통합하는 것보다 볼륨을 잃는 것이 좋습니다. 오일을 포함하면 리포솜이 파열되고 내부 구성 요소가 외부 버퍼로 방출됩니다. 전단을 줄이기 위해 피펫의 끝을 자릅니다.

3. 현미경 관찰

  1. 100μL의 OB를 인큐베이션 챔버(12mm 원형 커버슬립을 포함하는 4-웰 플레이트)의 웰에 붓는다. 수집된 리포좀(단계 2.4.4)을 OB에 부드럽게 증착한 다음, 챔버 상부에 또 다른 커버슬립을 놓는다.
    참고: OB는 유리 표면을 부동태화하고 리포솜(20) 사이의 접착을 최소화하기 위해 β-카제인을 함유한다.
  2. 63x 오일 침지 목표를 사용하여 공초점 현미경으로 리포솜을 관찰하십시오. 488nm, 647nm 및 561nm 레이저 라인을 사용하여 형광 표지된 지질, 캡슐화된 형광 염료 및 캡슐화된 형광 표지된 액틴을 각각 관찰하십시오. 관심 프레임을 캡처하고 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.
  3. ImageJ/피지39에서 이미지를 처리하고 분석합니다. ImageJ / 피지의 신규 사용자의 경우 온라인 자습서를 사용할 수 있습니다 ( 자료 표 참조).
    1. ImageJ/피지 소프트웨어를 사용하여 TIFF 파일을 엽니다.
    2. 이미지로 이동 하> 밝기/대비 조정>십시오. 최소 및 최대 설정, 밝기 및 대비 슬라이더를 조정하여 이미지의 밝기와 대비 를 원하는 배율로 조정합니다.
    3. 도구 모음에서 사각형 선택 도구를 클릭하고 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 이미지 > 자르 기로 이동하여 ROI를 자릅니다.
    4. 분석 >율 설정으로 이동합니다. 팝업 창에서 픽셀 종횡비 필드에 1.0을 입력하고 μm을 길이 단위로 설정합니다. 픽셀의 거리 필드에 이미지 너비를 픽셀 단위로 입력합니다. 알려진 거리 필드에 실제 이미지 너비를 미크론 단위로 입력합니다.
    5. 리포솜의 크기를 측정하려면 도구 모음의 타원형 선택 도구를 사용하여 리포솜의 가장자리를 따라 원을 그립니다. 분석 > 측정으로 이동하여 리포솜의 직경을 계산할 수있는 원의 면적을 측정하십시오.

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결과

반전된 에멀젼 기술에 기초한 리포좀의 제조는 도 1에 그래픽으로 그리고 개략적으로 도시되어 있다.

먼저, 비어있는(bare) 리포좀(직경 5-50 μm)을 인지질(EPC)과 형광 지질(DHPE)로 구성하여 제조하였다. 밝고 먼 적색 형광 염료를 대조군 실험으로서 베어 리포좀 내에 캡슐화하였다. 지질 단일층이 액적의 주변에서 성공적으로 형성되었는지 여부는 도 2A에 도시된 바와 같이 에멀젼에 형광 염료를 혼입시키는 단층 지질 액적을 관찰함으로써 결정될 수 있었다. 성공적인 리포좀 생성은 공초점 현미경을 사용하여 488 nm 레이저 하에서 녹색 형광 지질 이중층 (DHPE와 지질의 접합)인 얇은 원형 고리의 시각화를 통해 검증 될 수 있습니다 (그림 2A, 맨 오른쪽 패널). 형광 염료의 캡슐화를 확인하기 위해, 리포솜의 내...

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토론

몇 가지 주요 단계는 준비 과정 동안 리포솜의 높은 수율의 성공을 결정합니다. 오일에 지질 필름을 완전히 용해시키기 위해서는 유리 바이알 바닥의 지질 막이 완전히 사라질 때까지 샘플을 초음파 처리해야합니다. 초음파 처리 후, 지질-오일 혼합물은 지질 분자가 추가로 분산되기 위해 어두운 조건 하에서 실온에서 밤새 저장되어야 한다(29). 혼합물은 최대 일주일 동안 4°C에서 저장될 수 있다. 관심있는 단백질을 포함하는 단층 지질 방울로 FB / 오일 에멀젼을 준비 할 때, 지질 - 오일 - FB 혼합물은 기포가 발생하지 않도록 유리 주사기를 통해 앞뒤로 부드럽게 펌핑해야합니다. 이 과정에서 하나의 큰 물방울이 유리 주사기의 끝에서 여러 번 반복 된 후 많은 작은 물방울 (직경 ~ 5-100 μm)으로 전단됩니다. 혼합물은 공정(30) 이후에 희끄무레해야 한다. 인지질의 품질을 확인하기 위해, 액적을 함유하는 FB의 주변부에 지질 단일층이 성공적으...

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공개 사항

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 ARO MURI W911NF-14-1-0403을 M.P.M., 국립 보건원 (NIH) R01 1R01GM126256에서 M.P.M., 국립 보건원 (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, 미시간 대학 / 제넨테크, SUBK00016255 및 인간 국경 과학 프로그램 (HFSP) 보조금 번호 RGY0073 / 2018을 M.P.M.에 지원하는 것을 인정합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 ARO, NIF 또는 HFSP의 견해를 반드시 반영하지는 않습니다. S.C.는 V. Yadav, C. Muresan, S. Amiri와의 유익한 토론을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-{[n(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세트산]숙시닐} 니켈염(DOGS-NTA-Ni) 아반티 폴라 지질 Inc.231615773니켈 지질
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octaneSigmaD27802-25GDABCO
Actin 단백질(>99% 순수): 토끼 골격근Cytoskeleton, IncAKL99-D비형광 G-actin
Actin 단백질(로다민): 토끼 골격근Cytoskeleton, IncAR05형광 표지된 actin
Adenosine 5′-triphosphate 다이소듐 염 수화물시그마A2383-10GATP
알렉사 플루어 647 염료ThermoFisher형광 염료
Andor iQ3Andor Technologies제어 및 수집 소프트웨어
Arp2/3 단백질 복합체: Porcine BrainCytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
염화칼슘 이수화물시그마10035048CaCl2
Chamlide Chambers (12mm 원형 커버슬립용 4웰)Quorum Technologies배양 챔버
코필린 단백질: 인간 재조합세포골격, IncCF01-C코필린
컨포칼 현미경(63회; 오일 이멀젼 대물렌즈)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528포도당
디티오트레이톨DOT 과학 DSD11000-10DTT
겔솔린 단백질: 호모 사피엔스 재조합세포골격, IncHPG6겔솔린
해밀턴 1750 기밀 주사기, 500 &마이크로; L, 시멘트 바늘, 22G, 2 "원뿔형 팁Cole-ParmerUX-07940-53유리 주사기
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ / 피지https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-PhosphatidylcholineAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
염화 마그네슘시그마7786303MgCl2
미네랄 오일, BioReagent, 분자 생물학, 경유Sigma8042475미네랄 오일
N-WASP fragment WWA (aa400– 501, VCA-His)VCA-His는실험실 프로토콜을 사용하여 정제됩니다. 프로토콜은 합리적인 요청에 따라 제공될 수 있습니다
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
염화칼륨시그마7447407KCl
수크로오스시그마57-50-1수크로오스
&베타;-소우유 카제인시그마C6905-250MG
컨포칼 현미경용 :

참고문헌

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