방법 논문

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

DOI:

10.3791/64027

⸱

2022년 7월 22일

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1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

초록

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선충류 Caenorhabditis elegans 는 숙주 - 미생물 및 숙주 - 미생물 상호 작용을위한 모델 시스템입니다. 현재까지 많은 연구는이 유기체의 박테리아 부하를 정량화하기 위해 개별 웜 샘플보다는 배치 다이제스트를 사용합니다. 여기서 C. elegans 장의 박테리아 식민지화에서 볼 수있는 큰 개인 간 변동성은 유익하며, 배치 소화 방법은 조건 간 정확한 비교에 중요한 정보를 폐기한다고 주장합니다. 이러한 샘플에 내재 된 변형을 설명하는 것은 많은 수의 개인을 필요로하기 때문에 개별 웜의 파괴 및 콜로니 도금을위한 편리한 96 웰 플레이트 프로토콜이 확립됩니다.

서론

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숙주-미생물 연관성에서의 이질성은 유비쿼터스적으로 관찰되며, 개인들 사이의 변이는 경쟁과 공 존1에서 질병 전달 2,3,4에 이르는 집단 수준 과정에 기여하는 요인으로 점점 더 인식되고 있다. C. elegans에서, isogenic 집단 내의 "숨겨진 이질성"이 반복적으로 관찰되었으며, 열 충격 반응 5,6, 노화 및 수명 7,8,9,10,11 및 생리학 및 발달의 많은 다른 측면에서 뚜렷한 표현형을 보이는 개인의 하위 집단 12 . 하위 집단 구조를 확인하려는 대부분의 분석은 동종 ....

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프로토콜

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이 실험에 사용 된 웜은 NIH Office of Research Infrastructure Program (P40 OD010440)이 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetic Center에서 얻었습니다. 브리스톨 N2는 야생형입니다. DAF-2/IGF 돌연변이체 daf-16(mu86) I(CGC CF1038) 및 daf-2 (e1370) III(CGC CB1370) 는 장내 박테리아 부하의 차이를 설명하기 위해 사용된다.

포즈-1 RNAi 벡터를 운반하는 HT115(DE3) 대장균은 아링거 라이브러리(21)로부터 유래한다. C. elegans 천연 장내 박테리아22의 MYb 수집은 Schulenburg 실험실로부터 수득되었다. 살모넬라 엔테리카 LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR은 이 실험실23에서 나온 것입니다. 슈도모나스 모셀리(Pseudomonas mosselii)는 이 실험실에서 격리되었다. 황색포도상구균 MS....

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결과

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살아있는 벌레의 표백제 살균
표면 표백 된 웜은 운동성이 회복되고 배설이 재개 될 때까지 외부 박테리아가 효과적으로 없습니다. 여기에 사용된 조건 하에서, 냉마비 웜에서 장-관련 박테리아를 방해하지 않으면서 완충액 내의 박테리아의 급속한 멸종이 관찰된다(도 1A-C, 보충 그림 2, 비디오 1). 이러한 데이터는 표면 표백이 장 내용물을 손상시키지 않고 외부에서 웜을 살균하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 나타냅니다 (표면 표백 된 웜과 표백되지 않은 웜 관련 CFU 카운트의 비교는 중요하지 않습니다, Wilcoxon 랭크 합계 테스트 p > 0.05).

다중 샘플 기계적 중단에 대한 변형

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토론

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여기서 데이터는 C. elegans의 박테리아 부하의 단일 웜 정량화의 이점과 96-well 파괴 프로토콜에 대해 제시되어 이러한 유형의 대규모 데이터 세트를 신속하고 일관되게 수집 할 수 있습니다. 기존의 방법(33)과 비교하여, 이들 프로토콜은 웜 내의 장내 미생물 군집의 더 높은 처리량 측정을 허용한다.

이 접근법은 도금을 속도 제한 단계로 가지며 진정한 "높은 처리량"이 아닙니다. 대개체 유세포 분석기(도 3C,D)는 개별 웜(16)에서 형광 표지된 박테리아를 정량화하는 데 유용한 고처리량 방법이지만, 동시 형광단의 수는 다종 군집에서는 한계가 있다. 다중 웰 플레이트 중단을 커뮤니티 시퀀싱과 연결하는 것은 처리량을 늘리는 또 다른 방법입니다. 그러나, 여기에 기술된 96-웰 파괴 절차는 .......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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저자들은 H. Schulenberg와 C. LaRock이이 실험에 사용 된 박테리아 균주를 관대하게 공유 한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작업은 Emory University와 NSF (PHY2014173)의 기금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 평면 바닥 폴리프로필렌 플레이트, 300uLEvergreen Labware290-8350-03F
96웰 플레이트 밀봉 매트, 실리콘, 사각 웰(AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
96웰 플레이트, 2mL, 사각 웰AxygenP-2ML-SQ-C-S
96웰 폴리프로필렌 플레이트 뚜껑Evergreen Labware290-8020-03L
한천Fisher Scientific443570050
96웰 플레이트용 비드 밀 어댑터 세트QIAGEN119900TissueLyser II에서 2개의 96웰 플레이트와 함께 사용하기 위한 어댑터 플레이트
, 비드 밀 조직 균질화기(TissueLyser II)QIAGEN85300중간에서 고처리량 시료 파괴를 위한 기계적 균질기
BioSorterUnion, Biometrica견적에 의해C. elegans
Bleach, 상업용, 8.25% 차아염소산나트륨Clorox
Breathe-Easy 96웰 가스 투과성 밀봉 멤브레인Diversified BiotechBEM-1Multiwell 플레이트 가스 투과성 폴리우레탄 멤브레인. 얇은 밀봉 필름은 O2, CO2 및 수증기를 투과할 수 있으며 300nm까지 UV 투과성이 있습니다. 멸균, 100/상자.
칼슘 클로라이드 디하이드레이트Fisher ScientificAC423525000
콜레스테롤VWRAAA11470-30
시트르산 모노하이드레이트Fisher ScientificAC124910010
구리 (II) 황산염 펜타하이드레이트Fisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE 미니 마이크로 원심분리기Corning  COR-6765
디소듐 EDTAFisher Scientific409971000
DL 1,4 디티오트레이톨, 99+%, mol 생물학, DNAse, RNAse 및 프로테아제 무함유, ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, naturalEppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifugeEppendorf540600064024홀 냉장 실험대용 마이크로 원심분리기
Eppendorf 5810R 원심분리기, 로터 S-4-104포함, Eppendorf226270403L 실험대용 원심분리기, 15-50 mL 튜브 및 플레이트용 어댑터,
Eppendorf plate bucket (x2), Rotor S-4-104Eppendorf22638930
Ethanol 100%용Fisher ScientificBP2818500
유리 구슬, 2.7 mm생명 과학 제품LS-79127
유리 구슬, 산 세척, 425-600 &마이크로; mSigmaG877-500G
유리 도금 구슬VWR76005-124
염산VWRBDH7204-1
철(II) 황산염 헵타하이드레이트Fisher Scientific423731000
Kimble Kontes 펠릿 유봉 모터DWK Life Sciences749540-0000
Kimble Kontes 폴리프로필렌 펠릿 유봉 및 마이크로튜브, 0.5 mLDWK Life Sciences749520-0590
Leica DMi8 전동 도립 현미경(전동 스테이지 포함Leica11889113
Leica LAS X Premium 소프트웨어Leica11640687
Magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificAC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrateVWR470301-706
PARAFILM M 유연한 실험실 밀봉 필름AmcorPM996
펩톤Fisher ScientificBP1420-500
페트리 접시, 원형, 10cmVWR25384-094
페트리 접시, 원형, 6cmVWR25384-092
페트리 접시, 사각형, 10 x 10cmVWR10799-140
인광 완충 식염수(1X PBS)Gold BioP-271-200
폴리프로필렌 오토클레이브 트레이, 얕은Fisher Scientific13-361-10
수산화칼Fisher ScientificAC134062500
인산칼륨 이염기성Fisher ScientificBP363-1
인산칼륨 일염기성 Fisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
스쿠프형 실험실 주걱, 금속VWR470149-438
실리콘 카바이드 36MJR 텀블러n/a검은색 엑스트라 굵�은 실리콘 카바이드 그릿. 이 공급업체에서 0.5-5lb 크기로 제공됩니다.
황산나트륨Fisher ScientificBP166-100
수산화나트륨VWRBDH7247-1
인산나트륨 이염기성 무수Fisher ScientificBP332-500
염화나트륨Fisher ScientificBP358-1
자당Fisher ScientificAC419760010
삼중 칼륨 구연산염 일수화물Fisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
황산아연 헵타하이드레이트Fisher ScientificAC205982500
, , , 을 위한 250미크론 초점이 장착된 대형 물체 분류기 , , ) 륨 방

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heter....

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Caenorhabditis ElegansBacterial ColonizationHost Microbe InteractionsSingle Worm Quantification96 Well PlateMechanical DisruptionColony PlatingSurface BleachingSerial DilutionIntestinal Bacterial Load

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