방법 논문

시험관 내에서 칼슘 침착을 정량화하기 위한 반자동화되고 재현 가능한 생물학적 기반 방법

DOI:

10.3791/64029

⸱

2022년 6월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, Biointerface Group, RWTH Aachen University, 3Institute of Experimental Medicine and Systems Biology, RWTH Aachen University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 혈관 석회화는 심혈관 이환율 및 사망률의 부담에 실질적으로 기여합니다. 이 프로토콜은 형광 영상화에 의해 시험관내에서 혈관 평활근 세포 매개 칼슘 침전을 정량화하는 간단한 방법을 설명합니다.

초록

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혈관 석회화는 염증, 세포 표현형의 변화, 세포 사멸 및 석회화 억제제의 부재를 포함한 일련의 퇴행성 병리를 수반하여 혈관 탄력 및 기능의 상실로 이어집니다. 혈관 석회화는 만성 신장 질환, 당뇨병 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 많은 병리학에서 이환율과 사망률에 중요한 기여를합니다. 혈관 석회화를 연구하기 위한 현재의 연구 모델은 제한적이며 생체 내 석회화 발달의 후기 단계에서만 실행 가능합니다. 혈관 석회화를 연구하기 위한 시험관 내 도구는 종말점 측정을 사용하여 생물학적 물질에 대한 요구를 증가시키고 연구 연구에 가변성을 도입할 위험이 있습니다. 우리는 인간 혈관 평활근 세포에서 시험관 내 석회화 발달에 결합하고 시험관 내 석회화의 실시간 발달을 결정하는 새로운 형광 표지 프로브의 적용을 시연합니다. 이 프로토콜에서는 잠재적인 번역 응용 프로그램이 있는 질병 모델링의 새로운 도구인 새로 개발된 석회화 분석의 적용을 설명합니다. 우리는 이 분석이 뼈, 연골 또는 치과 연구의 응용을 포함하여 광범위한 광물 침착 연구와 관련이 있을 것으로 예상합니다.

서론

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혈관 석회화 (VC)는 심혈관 이환율 및 사망률 1,2,3에 대한 독립적 인 위험 요소입니다. 오랫동안 이소성 광물 침착의 수동적 화학적 과정으로 간주되었던 이 반응은 이제 질병 4,5의 동인으로서 활성화된 혈관 평활근 세포(hVSMC)를 포함한 다양한 세포의 능동적 기여를 포함하는 수정 가능한 조직 치유 반응으로 나타납니다. 생체 내 VC는 죽상 경화성 부담 6,7,8의 평가로서 다중 슬라이스 CT 스캔으로 측정 할 수 있습니다. 현재, VC 중증도가 심혈관 질환, 제 2 형 당뇨병, 만성 신장 질환 및 노화 9,10,11,12,13,14,15의 위험 인자로 인식되고있는 패러다임 전환이 진행 중이다.

hVSMC는 심혈 관계에서 가장 풍부한 세포 유형이며 VC 개발의 주요 행위자입니다. 시험관내 hVSMC-유도 석회화는 심혈관 질환16,17을 연구하기 위해 널리 사용되는 질환 모델이다. 그러나 체외 석회화 검출을 위한 대부분의 프로토콜은 데이터 수집을 제한하고 세포 물질의 더 많은 사용을 요구하며 연구를 늦출 수 있는 종말점 측정을 사용합니다. 시험관 내 hVSMC 석회화의 검출을 위한 일반적인 방법에는 o-크레솔프탈레인 분석법이 포함되며, 이는 총 단백질에 대한 가용화된 칼슘 침착을 측정하고 세포 용해를 필요로 합니다18. 또한, 고정된 세포 또는 조직 상의 칼슘 침착물에 직접 결합하는 알리자린 레드 염색이 사용된다(19). o-크레솔프탈레인 또는 알리자린 레드를 사용하여 시간 경과에 따른 hVSMC 석회화를 연구하려면 시점당 반복실험 배치가 필요하므로 생물학적 물질에 대한 수요가 증가하고 결과적으로 변동성이 증가합니다.

이 백서에서는 hVSMC를 형광 이미징 프로브와 함께 사용하여 시험관 내 VC 진행을 결정하고 단일 말기 석회화 분석으로 기능하는 새로운 분석의 적용 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 이전에 이 분석이 o-크레솔프탈레인 및 알리자린 레드 방법과 직접 비교할 수 있으며 다양한 배양 조건을 구별하는 데 사용할 수 있음을 입증했습니다20. 실시간 측정에 더하여, 이 분석은 임상 VC 발달(20)을 위한 대용 마커로서 혈청 또는 혈장 샘플의 성향을 결정하는데 사용될 수 있다. 이것은 심혈관 과학 및 질병 모델링의 생물학적 전략의 적용에 도움이 될 것입니다. 분석의 추가 적용은 혈청 또는 혈장과 같은 혈액 구성으로부터 VC 중증도 또는 진행을 평가하기 위한 번역 BioHybrid 시스템으로서 사용될 수 있다.

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프로토콜

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1. 세포 파종, 유지 및 석회화 유도

  1. 1차 세포를 배양하려면 층류 캐비닛, 장갑 및 멸균 장비를 사용하십시오. 작업을 수행하기 전후에 손과 작업 공간을 소독하십시오. 달리 입증되지 않는 한 모든 일차 세포와 배양 배지를 잠재적인 생물학적 위험으로 취급하십시오. 바람직하게는 폐기 전에 잉여 세포 및 배지를 오토클레이브한다. 유독 가스를 방출하므로 화학적으로 비활성화하고 오토클레이브하지 마십시오.
  2. 코팅되지 않은 세포 배양 플레이트에서 hVSMC를 배양합니다.
  3. 10%-20% FBS 및 1% Pen/Strep이 보충된 M199 배지로 구성된 성장 배지에서 hVSMC를 일상적으로 유지하고 37°C 및 5%CO2에서 배양합니다.
  4. 70%-90% 컨플루언시에 셀을 분할합니다.
    1. 분할하려면 hVSMC를 PBS로 2x 세척합니다. 트립신을 첨가하고 37 °C에서 2-5 분 동안 배양하십시오. 현미경으로 세포의 분리를 확인하십시오.
    2. 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신 반응을 억제합니다. 세포를 350 x g 에서 4분 동안 원심분리하고 유지 배지에 펠릿을 재현탁합니다. hVSMC는 1:2 분할 체계를 따릅니다.
  5. 석회화 실험을 시작하려면 분할에 대한 지침에 따라 세포를 준비합니다(1.4.1단계). 재현탁시, 세포를 세고 밀도 10-15 x 103 cells/cm2의 48-웰 플레이트에 시드한다. 보충 그림 1에서 권장하는 대로 외부 웰의 사용을 피하고 세포를 시드합니다.
  6. 세포가 37°C 및 5%CO2에서 배양하는 동안 24시간(밤새) 동안 부착되고 회복되도록 한다.
  7. 세포를 PBS로 2x 부드럽게 세척하고, 2차 세척 후 나머지 모든 PBS를 조심스럽게 흡인한다.
  8. 석회화 배지를 부드럽게 첨가하고 37°C 및 5%CO2에서 더 배양한다. 석회화 배지에는 석회화 자극, 형광 표지된 페투인-A(예: 적색 형광 단백질[RFP])(1μg/mL) 및 HOECHST 33342(0.1μg/mL) 핵 염색 또는 유사한 살아있는 형광 핵 염색이 포함되어야 합니다. DAPI는 불 투과성이므로 사용하지 마십시오.
  9. 석회화가 발생할 때까지 광학 현미경으로 매일 확인하십시오.
    참고: hVMSC의 세포 배양 및 유지 관리에 대한 참고 사항은 보충 파일 1을 참조하십시오.

2. 이미징을 통한 석회화 감지

참고: 다음 프로토콜은 준비, 이미징 및 데이터 분석에서 수행해야 하는 일반적인 단계를 제공합니다. 자동 이미징 플랫폼 및 해당 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 단계에 대한 지침을 지원하는 스크린샷(자세한 내용은 재료 표 참조)은 보충 파일 2 및 보충 파일 3에 제공됩니다. 다른 이미징 기기 및 이미지 처리 도구가 이 프로토콜을 적용하는데 사용될 수 있다. 그러나 각 웰의 동일한 위치에서 반복적인 이미징은 의미 있는 데이터 수집에 매우 중요합니다. 모든 이미징 단계에서 석회화 및 재사용을 이미지화하는 프로토콜을 만드는 것은 재현 가능한 결과를 얻는 데 필요합니다. 방법을 처음 적용할 때는 아래 단계에 따라 이미징 전에 준비하십시오.

  1. 프로토콜 설정
    1. 소프트웨어를 열고 프로토콜 및 새로 만들기를 선택합니다.
    2. 절차를 선택하고 온도 설정을 클릭합니다. 팝업 창에서 온도를 37°C로, 기울기를 1°C로 설정하고 확인을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 원하는 플레이트 유형을 선택합니다. 이미지를 클릭하여 이미징 단계를 추가합니다. 반전된 이미저를 선택하고 [확인]을 클릭합니다.
    3. 세 개의 이미징 채널을 추가하고 DAPI(377, 447nm), RFP(531, 593nm) 및 명시야로 설정합니다. 체크 몽타주 상자를 선택하고 이미지의 원하는 수와 위치를 설정합니다. 2웰 플레이트의 경우 2 x 48이 일반적인 선택입니다. 각 웰의 더 나은 적용 범위를 나타내도록 겹침을 변경합니다. 이미징할 웰을 선택합니다. 관심있는 우물을 선택할 수있는 새 창이 열립니다.
    4. 초점 옵션을 클릭하여 초점 모드를 설정합니다. 새 창이 열립니다. 각 채널을 개별적으로 설정합니다. 일반적으로 우물은 "DAPI" 채널에 자동 초점이 맞춰집니다. 다른 모든 채널을 첫 번째 채널에서 고정 초점 높이 로 설정하고 OK를 클릭하여 설정합니다. 창을 닫습니다.
    5. 데이터 축소를 클릭하여 사전 설정 데이터 축소 단계를 시작하고 이미지 전처리를 선택합니다. 이 단계를 설정하면 형광 배경이 줄어듭니다. 확인을 선택하여 기본 설정을 적용합니다. 접두사 "TSF"를 사용하여 새 이미지 집합이 만들어집니다. 원본 이미지는 보존됩니다.
    6. 세포 분석을 선택하여 세포 수를 계산하는 단계를 설정합니다. 채널 드롭다운 메뉴에서 TSF DAPI 이미지를 선택합니다. 이미징을 수행한 후 추가 세부 정보를 설정합니다. 이 단계는 데이터 감소로 간주 될 수도 있습니다. 항상 원본 이미지를 유지하십시오.
    7. 통계를 선택하여 RFP(석회화) 신호의 분석을 준비합니다. 팝업 창에서 단계에 레이블을 지정하고 TSF RFP를 입력 채널로 선택합니다. 체크 상위 값 및 하위 값 상자. 하단 목록에서 전체 면적 상자를 선택합니다. 색상 효과 열에서 없음을 선택합니다. 팝업 창에서 사용자 지정을 클릭하고 배경 상자를 선택합니다. 이렇게 하면 쉽게 평가할 수 있도록 low-high에서 결과를 색상으로 구분합니다. 확인을 누릅니다.
    8. 공정한 판독을 위해 셀당 RFP 신호를 정규화합니다. 이렇게 하면 전체 면적이 셀별로 나뉩니다. 이 단계를 설정하려면 왼쪽에서 비율을 누릅니다. 팝업 창의 데이터 입력에 대해 1 RFP 정량화: 전체 면적 드롭다운 메뉴에서. 또한 선택 셀 카운트 데이터 입력으로 2.
    9. 마지막으로 새 데이터 세트 이름을 선택하고 OK를 누른 후 OK 를 다시 누릅니다. 앞에서 설명한 대로 색상 효과를 선택합니다. 왼쪽 위 모서리에서 파일을 선택하고 파일을 프로토콜(.prt 파일 형식)로 저장합니다.
  2. 첫 번째 석회화가 발생한 후 매일
    1. 모든 시점에 대해 이 단계를 반복합니다. 시작 소프트웨어에서 지금 읽기 및 기존 프로토콜...을 누릅니다. 이전 단계에서 만든 프로토콜을 선택합니다. 프로그램에서 실험을 저장하도록 요청합니다. 이 작업은 이 단계에서 수행할 수 있지만 왼쪽 상단의 저장 버튼을 클릭하여 이후 단계에서도 수동으로 수행할 수 있습니다.
    2. 팝업 창에서 시스템이 가열 될 때까지 기다리라는 메시지가 표시됩니다. CO2 가스 컨트롤러를 켜고 5 %로 설정하십시오.
    3. 시스템이 설정 온도에 도달하면 플레이트를 삽입하고 읽으라는 메시지가 나타납니다. 취소를 누릅니다. 이는 각 시점마다 각 형광 색소의 노출을 개별적으로 조정해야하기 때문입니다.
    4. 인큐베이터에서 이미 저로 플레이트를 파손 및 유출에 강하고 사고 발생시 살아있는 세포 운반에 대한 현지 생물 안전 규정을 준수하는 안전한 상자에 담아 운반하십시오. 플레이트를 플레이트 리더에 놓습니다.
    5. 취소 후 절차를 클릭하십시오. 팝업 창에서 이미징 단계 사전 설정을 선택합니다. 먼저 DAPI 채널의 초점과 노출을 조정합니다. 모든 채널에서 자동 노출 상자를 선택 취소합니다. 그런 다음 DAPI 채널 옆에 있는 현미경 아이콘을 클릭합니다. 새 창이 열립니다.
    6. 집중할 우물을 선택합니다. 이 단계에서는 석회화가 중간에서 높은 우물을 사용하십시오. 신호가 이미 보이는 경우 먼저 자동 초점을 클릭한 다음 자동 노출을 클릭합니다. 그렇지 않은 경우 먼저 노출을 늘리고 자동 초점 및 자동 노출을 반복하십시오. 원하는 경우 노출 드롭다운 메뉴를 선택하여 노출을 수동으로 조정할 수 있습니다. 여러 웰의 설정을 확인하십시오. 만족하면 설정을 저장하십시오.
    7. 모든 채널에 대해 동일한 방식으로 노출을 조정합니다.
      주의: 다른 채널에 집중하지 마십시오. 노출만 조정하십시오. 초점 평범은 모든 채널에서 동일해야 합니다.
    8. 프로시저 창을 닫습니다. 위쪽 작업 표시줄에서 녹색 Read Now 단추를 선택합니다. 소프트웨어에 표시된 대로 실험을 저장합니다.
      알림: 이제 소프트웨어가 선택한 설정에서 선택한 모든 웰을 자동으로 읽습니다.

3. 데이터 분석

참고: 자동 이미징 플랫폼 및 해당 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하는 방법에 대한 자세한 스크린샷(자세한 내용은 재료 표 참조)은 보충 파일 4를 참조하십시오. 대체 이미징 기기 또는 분석 소프트웨어를 사용하는 경우 이미지를 내보내고 일괄 처리하여 비교 데이터 세트의 모든 이미지에 대해 노출, 형광 임계값 또는 강도가 동일하게 조정되도록 해야 합니다.

  1. 시스템이 플레이트를 읽는 동안 모든 이미지가 백그라운드에서 자동으로 처리됩니다. 표시할 TSF DAPI 이미지를 선택하여 셀 수에 대한 설정을 조정합니다. 두 번 클릭하여 원하는 웰을 선택합니다. 새 창이 나타납니다. 이미지 중 하나를 선택합니다.
  2. 분석 탭을 선택합니다. 팝업 창에서 세포 분석: 세포 수를 선택합니다. 확인을 클릭합니다. RFP 및 명시야 채널을 선택 취소합니다. 개체 강조 상자를 선택합니다.
  3. 옵션을 클릭하여 메뉴를 엽니다. 모든 핵을 포함하되 파편을 제외하도록 크기와 강도 임계값을 조정합니다. 확인을 클릭합니다. 왼쪽 하단의 변경 사항 적용을 클릭하여 설정을 다른 모든 이미지에도 전송합니다.
  4. 이전과 유사한 방식으로 신호 대 잡음비를 가장 잘 조정하기 위해 석회화가 중간에서 높은 웰과 이미지를 선택합니다. 작업 메뉴에서 분석 탭을 클릭합니다.
    1. 이번에는 이미지 통계를 선택합니다. DAPI 및 명시야 채널을 선택 취소합니다. 옵션을 클릭하여 메뉴를 엽니다. 임계값 이상값 상자를 선택합니다. 임계값의 상한 및 하한 값을 조정합니다. 신호가 배경 위에 있는 경우에만 신호를 계산하고 파편/아티팩트가 있는 경우 제외합니다.
    2. 배경 위의 신호에 대해 주관적이지 않은 임계값을 설정하려면 작업 표시줄에서 선 도구를 선택합니다. 창이 나타납니다. 신호 패치를 통해 선을 그리되 배경 영역도 포함해야 합니다.
      참고: 팝업 창에 그래프가 나타나 배경선 위의 신호를 나타내는 피크를 보여줍니다. 25% 피크 높이 값은 권장 임계값을 나타냅니다. 또한 올바른 임계값을 선택할 수 있도록 여러 신호 패치를 측정하는 것이 좋습니다. 신호 패치를 선택하는 동안 신호 강도가 매우 높은 영역을 선택하면 중간 또는 더 낮은 신호를 무시하는 임계값이 발생할 수 있습니다. 따라서 배경 위의 중간에서 낮은 신호 패치를 선택하는 것이 좋습니다. 너무 높거나 너무 낮고 정확한 임계값의 예는 보충 파일 4에 나와 있습니다.
    3. 만족하면 확인 및 변경 사항 적용을 클릭하여 설정을 다른 모든 웰로 전송합니다. 다른 웰에서 임계 값이 정확하게 선택되었는지 확인하십시오.
  5. 셀 수 및 RFP 임계값이 설정되면 데이터를 내보냅니다. 관심 플레이트를 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 내보낼 여러 매개변수를 선택할 수 있습니다. 관련성은 셀 수, RFP 영역 및 그룹 간 비교에 사용되는 메트릭인 "영역/셀"일 수 있습니다. 드롭다운 메뉴 옆에 있는 Excel 버튼을 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 직접 내보냅니다.
    참고: 드롭다운 메뉴에서 셀 수에 대해 계산된 값, RFP 신호의 총 면적(석회화 영역 반영) 및 셀당 RFP 신호의 총 면적의 정규화된 비율을 이제 개별적으로 선택하고 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다. 결과를 셀당 RFP 신호의 전체 면적의 비율로 표시하고 시각화합니다(예: 막대 그래프). 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 적용하여 두 그룹을 비교하거나 쌍을 이루지 않은 분산 분석을 적용하여 동시에 다른 그룹을 비교합니다. 서로 다른 시점에서 동일한 그룹을 비교하려면 쌍체 통계 분석이 필요할 수 있습니다.

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결과

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결과에는 HOECHST 염색 핵의 원본 이미지, RFP 표지 석회화 및 명시야 이미지가 포함됩니다. 낮음(그림 2)에서 높음(그림 3)에 이르는 다양한 석회화 단계를 감지하고 분석할 수 있습니다. 석회화는 일반적으로 광학 현미경(그림 2D 및 그림 3B, 화살표는 석회화를 나타냄)을 사용하여 검은색 얼룩으로 발견할 수 있으며, 이는 1차 평가 및 이미징 시작 시기를 결정하는 데 유용합니다. 신호 대 잡음비를 개선하려면 처리된 RFP 이미지를 분석하여 석회화를 정량화해야 합니다(그림 2F 및 그림 3D, 화살표는 석회화를 나타냄). 마지막으로, 데이터는 대표 이미지와 함께 한 시점에서 둘 이상의 조건을 비교하는 막...

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토론

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이 원고에서는 체외 석회화 측정을위한 반자동 방법을 설명합니다. 이 방법의 경우 hVSMC 석회화의 세 가지 중요한 단계를 최적화해야 합니다. 첫째, 세포 밀도는 hVSMC 석회화 발달에 중요합니다. hVSMC의 낮은 밀도는 석회화 조건21 하에서 유도되는 세포 간 접촉 및 스트레스의 부족으로 인해 석회화 및 세포 사멸이 느리거나 전혀 없을 것이다. 높은 세포 밀도는 과도한 합류를 초래하고, 그 후에 세포는 노화22 가되고 석회화 발달이 멈 춥니 다. 후속 석회화 발달에 사용될 웰 플레이트에 약 70%의 컨플루언스를 시딩하여 hVSMC의 증식 능력과 세포 연결을 보장하는 것이 중요합니다.

둘째, 석회화 유도에 사용될 세포 배양 배지는 최적화가 필요합니다. 혈관 석회화 연구 내에서, 다양한 조건 및 배지 조성물이 hVSMCs23,24

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공개 사항

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Leon Schurgers는 Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma 및 IDS로부터 기관 보조금을 받았습니다. Leon Schurgers는 Coagulation Profile의 주식을 소유하고 있습니다. Willi Jahnen-Dechent는 CALCISCON AG의 공동 설립자이자 주주입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 마리 스클로도프스카-퀴리 보조금 계약 722609 및 764474, NWO ZonMw(MKMD 40-42600-98-13007)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램의 자금 지원을 받았습니다. 이 연구는 BioSPX의 지원을 받았습니다. WJ-D는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)로부터 자금을 지원 받았다. TRR219-프로젝트 ID 322900939 및 프로젝트 ID 403041552

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화칼슘, 93%, 무수Thermo Fisher Scientific349615000
Costar 6-well Clear TC 처리 웰 플레이트Corning3516
Cytation 3 SystemBioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine SerumMerckF7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546사내
Gen5 소프트웨어 v3.10BioTek
Gibco Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059
Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드Thermo Fisher ScientificH3570
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044
페니실린-스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15140122
트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드Thermo Fisher Scientific25300062
준비

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  20. Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097(2021).
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