시험관 내에서 칼슘 침착을 정량화하기 위한 반자동화되고 재현 가능한 생물학적 기반 방법

요약

심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 혈관 석회화는 심혈관 이환율 및 사망률의 부담에 실질적으로 기여합니다. 이 프로토콜은 형광 영상화에 의해 시험관내에서 혈관 평활근 세포 매개 칼슘 침전을 정량화하는 간단한 방법을 설명합니다.

초록

혈관 석회화는 염증, 세포 표현형의 변화, 세포 사멸 및 석회화 억제제의 부재를 포함한 일련의 퇴행성 병리를 수반하여 혈관 탄력 및 기능의 상실로 이어집니다. 혈관 석회화는 만성 신장 질환, 당뇨병 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 많은 병리학에서 이환율과 사망률에 중요한 기여를합니다. 혈관 석회화를 연구하기 위한 현재의 연구 모델은 제한적이며 생체 내 석회화 발달의 후기 단계에서만 실행 가능합니다. 혈관 석회화를 연구하기 위한 시험관 내 도구는 종말점 측정을 사용하여 생물학적 물질에 대한 요구를 증가시키고 연구 연구에 가변성을 도입할 위험이 있습니다. 우리는 인간 혈관 평활근 세포에서 시험관 내 석회화 발달에 결합하고 시험관 내 석회화의 실시간 발달을 결정하는 새로운 형광 표지 프로브의 적용을 시연합니다. 이 프로토콜에서는 잠재적인 번역 응용 프로그램이 있는 질병 모델링의 새로운 도구인 새로 개발된 석회화 분석의 적용을 설명합니다. 우리는 이 분석이 뼈, 연골 또는 치과 연구의 응용을 포함하여 광범위한 광물 침착 연구와 관련이 있을 것으로 예상합니다.

서론

혈관 석회화 (VC)는 심혈관 이환율 및 사망률 ^1,2,3에 대한 독립적 인 위험 요소입니다. 오랫동안 이소성 광물 침착의 수동적 화학적 과정으로 간주되었던 이 반응은 이제 질병 ^4,5의 동인으로서 활성화된 혈관 평활근 세포(hVSMC)를 포함한 다양한 세포의 능동적 기여를 포함하는 수정 가능한 조직 치유 반응으로 나타납니다. 생체 내 VC는 죽상 경화성 부담 ^6,7,8의 평가로서 다중 슬라이스 CT 스캔으로 측정 할 수 있습니다. 현재, VC 중증도가 심혈관 질환, 제 2 형 당뇨병, 만성 신장 질환 및 노화 9,10,11,12,13,14,15의^<....

프로토콜

1. 세포 파종, 유지 및 석회화 유도

1. 1차 세포를 배양하려면 층류 캐비닛, 장갑 및 멸균 장비를 사용하십시오. 작업을 수행하기 전후에 손과 작업 공간을 소독하십시오. 달리 입증되지 않는 한 모든 일차 세포와 배양 배지를 잠재적인 생물학적 위험으로 취급하십시오. 바람직하게는 폐기 전에 잉여 세포 및 배지를 오토클레이브한다. 유독 가스를 방출하므로 화학적으로 비활성화하고 오토클레이브하지 마십시오.
2. 코팅되지 않은 세포 배양 플레이트에서 hVSMC를 배양합니다.
3. 10%-20% FBS 및 1% Pen/Strep이 보충된 M199 배지로 구성된 성장 배지에서 hVSMC를 일상적으로 유지하고 37°C 및 5%_CO2에서 배양합니다.
4. 70%-90% 컨플루언시에 셀을 분할합니다.
   1. 분할하려면 hVSMC를 PBS로 2x 세척합니다. 트립신을 첨가하고 37 °C에서 2-5 분 동안 배양하십시오. 현미경으로 세포의 분리를 확인하십시오.
   2. 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신 반응을 억제합니다. 세포를 350 x g 에서 4분 동안 원심분리하고 유지 배지에 펠릿을 재현탁합니다. hVSMC는 1:2 분할 체계를 따릅니다.
....

결과

결과에는 HOECHST 염색 핵의 원본 이미지, RFP 표지 석회화 및 명시야 이미지가 포함됩니다. 낮음(그림 2)에서 높음(그림 3)에 이르는 다양한 석회화 단계를 감지하고 분석할 수 있습니다. 석회화는 일반적으로 광학 현미경(그림 2D 및 그림 3B, 화살표는 석회화를 나타냄)을 사용하여 검은색 얼룩으로 발견할 수 있으며, 이는 1차 평가 및 이미징 시작 시기를 결정하는 데 유용합니다. 신호 대 잡음비를 개선하려면 처리된 RFP 이미지를 분석하여 석회화를 정량화해야 합니다(그림 2F 및 그림 3D, 화살표는 석회화를 나타냄). 마지막으로, 데이터는 대표 이미지와 함께 한 시점에서 둘 이상의 조건을 비교하는 막.......

토론

이 원고에서는 체외 석회화 측정을위한 반자동 방법을 설명합니다. 이 방법의 경우 hVSMC 석회화의 세 가지 중요한 단계를 최적화해야 합니다. 첫째, 세포 밀도는 hVSMC 석회화 발달에 중요합니다. hVSMC의 낮은 밀도는 석회화 조건²¹ 하에서 유도되는 세포 간 접촉 및 스트레스의 부족으로 인해 석회화 및 세포 사멸이 느리거나 전혀 없을 것이다. 높은 세포 밀도는 과도한 합류를 초래하고, 그 후에 세포는 노화²² 가되고 석회화 발달이 멈 춥니 다. 후속 석회화 발달에 사용될 웰 플레이트에 약 70%의 컨플루언스를 시딩하여 hVSMC의 증식 능력과 세포 연결을 보장하는 것이 중요합니다.

둘째, 석회화 유도에 사용될 세포 배양 배지는 최적화가 필요합니다. 혈관 석회화 연구 내에서, 다양한 조건 및 배지 조성물이 hVSMCs^23,24

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화칼슘, 93%, 무수	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6-well Clear TC 처리 웰 플레이트	Corning	3516
Cytation 3 System	BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	사내
Gen5 소프트웨어 v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
페니실린-스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific	15140122
트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드	Thermo Fisher Scientific	25300062

준비