본원은 CAR-T 세포 치료를 위한 T 세포를 포함하는 T 세포의 유전공학에 사용하기 위한 효율적인 바이러스 유전자 전달을 매개하는 건식 거대다공성 알기네이트 스캐폴드를 생성하기 위한 프로토콜이다. 스캐폴드는 활성화된 1차 T 세포를 >85% 형질도입으로 형질도입하는 것으로 나타났다.
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이 논문에서
요약
초록
CAR-T 세포 치료를 위한 T 세포의 유전 공학은 지난 몇 년 동안 암 치료의 최전선에 왔습니다. CAR-T 세포는 T 세포로의 바이러스 유전자 전달에 의해 생성됩니다. 바이러스 유전자 전달의 현재 황금 표준은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 레트로넥틴 코팅 플레이트의 스피노클로테이션을 포함합니다. CAR-T 세포를 생성하기 위한 효율적이고 비용 효율적인 방법에 대한 상당한 요구가 존재한다. 여기에 설명된 것은 활성화된 T 세포의 바이러스 형질도입을 효율적으로 촉진하는 Drydux 스캐폴드로 알려진 저렴하고 건조한 거대 다공성 알기네이트 스캐폴드를 제조하는 방법입니다. 스캐폴드는 바이러스가 파종된 레트로넥틴 코팅 플레이트의 금 표준 스피노큘레이션 대신 사용하도록 설계되었으며 세포 형질도입 공정을 단순화합니다. 알긴산염은 칼슘 -D- 글루코 네이트와 가교 결합되고 밤새 동결되어 스캐 폴드를 만듭니다. 동결된 스캐폴드는 동결건조기에서 72시간 동안 동결건조되어 건조 거대다공성 스캐폴드의 형성을 완료한다. 스캐폴드는 바이러스 및 활성화된 T 세포가 유전자 변형 세포를 생성하기 위해 스캐폴드 위에 함께 파종될 때 바이러스 유전자 전달을 매개합니다. 스캐폴드는 >85%의 1차 T 세포 형질도입을 생성하며, 이는 레트로넥틴-코팅된 플레이트에서 스피노클로테이션의 형질도입 효율과 유사하다. 이러한 결과는 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드가 종래의 형질도입 방법에 비해 더 저렴하고 편리한 대안으로서 작용한다는 것을 입증한다.
서론
면역 요법은 종양을 특이적으로 표적으로 삼고, 표적을 벗어난 세포 독성을 제한하고, 재발을 방지하는 능력으로 인해 혁신적인 암 치료 패러다임으로 부상했습니다. 특히, 키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 요법은 림프종 및 백혈병 치료에 성공하여 인기를 얻고 있습니다. FDA는 2017 년에 최초의 CAR-T 세포 요법을 승인했으며 그 이후로 4 개의 CAR-T 세포 요법 1,2,3,4,5를 추가로 승인했습니다. CAR은 일반적으로 종양 관련 항원 3,4에 특이적인 단일클론 항체의 단일 쇄 가변 단편으로 구성된 항원 인식 도메인을 갖는다. CAR이 종양 관련 항원과 상호 작용할 때 CAR-T 세포가 활성화되어 사이토카인 방출, 세포용해 탈과립, 전사 인자 발현 및 T 세포 증식을 포함하는 항종양 반응을 일으킵니다. CAR-T 세포를 생산하기 위해 환자로부터 혈액을 수집하여 T 세포를 얻습니다. C....
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프로토콜
인간 우선 세포 및 레트로 바이러스 벡터와 관련된 모든 절차는 노스 캐롤라이나 주립 대학의 생물학적 안전 지침에 따라 수행되었으며 환경 보건 및 안전 사무소의 승인을 받았습니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포는 상업적 공급원으로부터 버피 코트로서 구입하였다. 1차 인간 세포는 인간 버피 코트 분획에서 분리되어야 하며 생물안전 레벨 2 허가와 상세한 표준 운영 절차 및 작업이 수행될 기관의 승인이 필요합니다. 앞서기술한 바와 같이 제조된 형질도입에 사용된 레트로바이러스 벡터 상청액을 포함한 바이러스 벡터는 코딩된 단백질에 따라 생물안전 레벨 1 또는 생물안전성 레벨 2로 분류될 수 있으며 관련 기관 생물안전 위원회의 승인이 필요합니다.
1. 거대다공성 알긴산 스캐폴드 만들기
- 비이커에서 칼슘 D 글루코네이트에 멸균 여과된 탈이온수를 첨가하여 0.4%(부피당 중량)의 칼슘 D 글루코네이트의 저장 용액을 준비합니다. 글루콘산칼슘이 녹을 때까지(~1.5시간) 중간 속도로 저어주고 필터를 멸균하고 실온에서 보관합니다.
알림: 용액의 pH를 확인할 필요는 없습니다. - 스크류 캡 바이알 또는 비커에 2 % (부피 당 중량) 알긴산 용액을 준비하십시오....
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결과
이러한 거대 다공성 알긴산 스캐폴드는 만들기 쉽고 동결건조기에서 다공성, 푹신한 흰색 디스크로 나와야 합니다. 이 실험에서 연구되지는 않았지만, 칼슘-알긴산 용액은 사용자 9,10의 필요에 따라 다양한 형상의 스캐폴드를 생성하기 위해 상이한 주형으로 주조될 수 있다. 비계는 정전기이며 웰 플레이트의 뚜껑이나 장갑을 낀 손가락에 달라붙을 수 있습니다. 그림 2는 완료 시 스캐폴드의 모양을 보여 줍니다. 24웰 및 48웰 스캐폴드의 대략적인 치수도 그림에 나와 있습니다.
그림 2
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토론
CAR-T 세포 요법은 연구 및 상업적 응용 분야에서 계속해서 관심을 얻고 있습니다. CAR-T 세포 요법이 혈액 암 치료에 성공했음에도 불구하고 절차의 높은 비용으로 인해 사용이 제한됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 레트로넥틴 코팅 플레이트의 스피노클로케이션 없이 T 세포의 바이러스 유전자 전달을 위한 새로운 방법을 소개합니다. 형질도입을 매개하기 위한 건식 거대다공성 알기네이트 스캐폴드의 제조는 비교적 간단하고, 종래의 방법에 대한 적합한 저비용 대체물이다.
때때로 비계 모양은 그림 2에 표시된 것과 다를 수 있으며 대신 흰색과 푹신한 것이 아니라 투명하고 결정적으로 보일 수 있습니다. 이는 냉동실 도어의 반복적 인 개방으로 인해 -20 ° C에서 일관되지 않은 동결로 인해 발생하거나 냉동 할 플레이트가 냉동실의 부피가 큰 품목 옆이나 위에 놓여 절연 된 경우에 발생할 수 있습니다. 외관의 차이에도 불구하고 우리 실험실은 .......
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공개 사항
P.A. 및 Y.B.는 CAR-T 세포 치료제의 생성을 위한 생체재료의 사용과 관련된 특허에 대한 발명가이다. Y.B.는 CAR-T 세포 치료 기술과 관련된 업계 후원 연구 보조금을 받습니다(이 연구와 관련이 없음). 다른 모든 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 보조금 수여 번호 R37-CA260223, R21CA246414를 통해 국립 보건원의 지원을 받았습니다. 유세포분석 분석에 대한 교육 및 지침에 대해 NCSU 유세포분석 코어에 감사드립니다. 회로도는 Biorender.com 사용하여 생성되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | 염화칼슘 또는 염화마그네슘 없음 |
| Stemcell Technologies Inc | 07060 | 를 사용한 3% 아세트산 | |
| 신선 또는 냉동 | |||
| 칼슘 -D- 글루 코네이 | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 항체 | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 항체 | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μ g/mL |
| 클릭의 매체 | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 매체 | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| 말초 혈액 단핵 세포 | - | - | 신선 또는 냉동 |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | 알긴산 나트륨 |
| 재조합 인간 IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| 재조합 인간 IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| 레트로바이러스 | - | - | 1 x 106 TU/ 밀리리터 |
참고문헌
- Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
- Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M.
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재인쇄 및 허가
