여기서 우리는 보조 순응 방법이라고 불리는 SD 쥐로부터 BMM을 분리하기위한 프로토콜을 제시합니다.
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방법 논문
이차 부착 방법에 의한 쥐 뼈로부터 단핵구-대식세포 계통 세포의 분리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
뼈 미네랄 밀도가 감소하면 뼈가 골절 될 가능성이 높아 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미칩니다. 뼈의 성장과 발달은 주로 조골 세포와 파골 세포에 의해 조절됩니다. 파골세포는 골수 단핵구-대식세포(BMMs)로부터 유래된다는 것이 널리 받아들여지고 있다. BMM 및 기타 조혈 줄기 세포는 골수 공동에 위치한다. 따라서, 상이한 이종 및 이종 세포 집단으로부터 단일 안정한 BMM을 단리하는 것은 큰 도전이다. 여기서 우리는 보조 순응 방법이라고 불리는 SD 쥐로부터 BMM을 분리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 일차 배양에서 24-48 h 동안 배양된 부착성 세포를 수집하였다. 유세포 분석 결과 세포의 약 37.94%가 CD11b/c+(단핵구-대식세포 표면 항원)인 것으로 나타났다. 타르트레이트 내성 산 포스파타제(TRAP) 염색 및 웨스턴 블롯 분석은 BMM이 시험관 내에서 파골세포로 분화될 수 있음을 입증하였다. 위의 발견은 이차 부착 세포가 파골세포 분화 연구에 적합한 세포 모델로 간주 될 수 있음을 시사했다.
서론
골수에 존재하는 단핵구-대식세포 혈통세포는 혈액 단핵구 및 조직 대식세포 1,2로 분화할 수 있다고 보고되었다. 뼈의 성장과 발달의 균형을 맞추기 위해 파골세포로 분화할 수 있는 상기 세포들은 일반적으로 생체내 파골세포를 유도하기 위한 세포 모델로서 사용된다3,4. 골수는 골수 중간엽 줄기 세포, 골수 단핵구 - 대식 세포 (BMMs), 조혈 줄기 세포, 내피 세포 및 면역 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 가지 유형의 세포를 포함하는 특수 조직입니다. 사실, 이전의 여러 연구에 따르면 긴 뼈의 골수강에서 밀려난 부착 세포는 조골 세포, 파골세포, 연 골 세포 또는 지방세포 5,6,7,8로 분화 될 수 있다고 제안했습니다. 상이한 동질적인 세포 집단을 생산하기 위해 상이한 분리 및 배양 방법이....
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프로토콜
본 연구의 모든 실험은 절강 중국 의과 대학 실험실 동물 연구 센터 (승인 번호 : IACUC-20181029-11)의 동물 실험 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 세포 추출
- Sprague-Dawley 래트 (SD 래트, 1-10 일령, 남성 또는 여성)를CO2 로 채워진 안락사 케이지에 30 % -70 % 용기 부피 / 분의 균형 잡힌 속도로 넣으십시오. 쥐가 의식을 잃은 후 (20-60 분), 통증없는 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시킵니다.
- 소독을 위해 쥐를 75 % 알코올에 10 분 동안 담그십시오.
- 조심스럽게 가위와 집게로 쥐의 모든 팔다리를 제거하고, 피펫을 사용하여 PBS로 흡인하고 팔다리에 부착 된 혈액을 씻어냅니다.
- 페니실린/스트렙토마이신 용액 5 mL를 DMEM 500 mL에 넣고 잘 섞는다. 50 mL 멸균 원심분리 튜브를 취하여 FBS 5 mL와 DMEM 배지 45 mL를 첨가하고 완전히 혼합하여 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 함유하는 10% FBS DMEM을 얻었다. 상기 배양액 2 mL를 5 mL 튜브에 첨가한다.
- 사지 뼈를 5 mL 튜브로 옮깁니다. 가위....
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결과
이차 부착성 세포 집단은 안정하고 균일하였다. 지속적인 세포 증식으로 대부분의 세포는 불규칙한 모양으로 더 커졌고 방사형 부착 디스크로 성장했습니다 (그림 2C, D). 유세포 분석기는 단핵구-대식세포 계통 세포의 표면에 있는 분자 마커인 CD11b/c를 발현하는 세포의 비율이 약 37.94%인 것으로 나타났다(도 2A, B). CD11b/c 양성 세포가 단핵구-대식세포 혈통 세포임을 추가로 확인하기 위해, RANKL 및 M-CSF로 세포 처리 후 이차 부착성 세포를 파골세포로 분화시켰다. TRAP 염색 결과는 대조군과 비교하여, RANKL 및 M-CSF로 유도된 세포에서 세포내 보라색-적색 과립의 수가 유의하게 증가하였다는 것을 보여주었다(도 2E
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토론
파골세포는 골 질환의 발생 및 발달에 관여하는 가장 중요한 세포 유형 중 하나이며, 골 질환 연구20의 주요 목적 중 하나입니다. 단핵구 / 대식세포는 파골세포로 분화 될 수 있습니다. 단핵 대식세포(RAW264.7 세포)는 구입하기에 너무 비싸고 배양 중에 쉽게 활성화되기 때문에, 이 세포주를 이용한 시험관내 분화 실험을 수행하는 것은 어렵다. 골수에서 단핵구/대식세포를 추출하기 위한 몇 가지 방법이 개발되었지만, 밀도 구배 원심분리, 콜라게나제 소화, 마이크로스피어 농축 및 유세포 측정(표 1), 이러한 방법은 시간이 많이 걸리지만 높은 시료 부피와 값비싼 장비가 필요합니다. 따라서 현재의 연구는 골수 샘플에서 단핵구 / 대식세포를 추출하는 간단하고 신속한 방법을 제안하는 것을 목표로했습니다.
골수에는 BMM 외에도 BMSC, 내피 세포 및 면역 세포를 포함한 많은 세포 집단이 있습니다........
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공개 사항
저자들은 그들이 경쟁하는 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 절강 성의 자연 과학 재단 (보조금 없음)의 지원을 받았다. LY19H060001) 및 절강 전통 중국 의학 과학 기술 계획 프로젝트 (no. 2022ZB093).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 35 mm2 세포 등반 슬라이스 | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μ g/test,1.675 mg/ml |
| 안티-CD11b/c | 앱신 | abs124232 | 1&뮤; g/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| 세포 등반 슬라이스 | NEST Biotechnology | 80102 | |
| 세포 배양 접시 | 코닝 | 430167 | |
| 세포 배양 플라스크 | 코닝 | 430168 | |
| Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco | 10099141C | |
| 염소 안티 토끼 IgG | Abcam | ab150077 | , WB용 1:2,000 |
| 염소 안티 토끼 IgG | Abcam | ab6721 | , 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10일 | |
| SDS-PAGE 젤 준비 키트 | , Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP 염색 키트 | , Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA 솔루션 | , Biosharp | BL512A, | |
| Wright-Giemsa 솔루션 | , Keygen Biotech | KGA225-1 |
참고문헌
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.....
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재인쇄 및 허가
