맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

외상성 손상 및 종양 제거는 크고 복잡한 연조직 결함을 유발할 수 있습니다. 이러한 결함은 환자의 삶의 질을 손상시키고 기능 상실을 유발하며 영구적 인 장애를 초래할 수 있습니다. 자가 조직 플랩 이식과 같은 기술이 일반적으로 시행되었지만 플랩 가용성 및 기증자 부위 이환율 문제는 주요 제한 사항입니다 ^1,2,3. 혈관화 복합 동종 이식(VCA)은 복합 조직, 예를 들어 근육, 피부, 혈관계를 단일 단위로 수혜자에게 전달하는 유망한 대안입니다. 그러나 VCA는 약물 독성, 기회 감염 및 악성 종양 ^4,5,6을 유발하는 장기 면역 억제가 필요합니다.

조직 공학적 무세포 스캐폴드는 이러한 한계에 대한 잠재적인 해결책입니다⁷. 무세포 조직 스캐폴드는 기본 세포외 기질(ECM) 마이크로아키텍처를 보존하면서 천연 조직에서 세포 물질을 제거하는 탈세포화 방법을 사용하여 얻을 수 있습니다. 조직 공학에서 합성 물질을 사용하는 것과는 대조적으로, 생물학적으로 유래 된 스캐 폴드의 사용은 생체 적합성 및 임상 번역 가능성을 허용하는 생체 모방 ECM 기질을 제공한다⁸. 탈세포화 후, 수용자-특이적 세포를 갖는 스캐폴드의 후속 재세포화는 면역원성이 거의 또는 전혀 없는 기능적이고 혈관화된 조직을 생성할 수 있다 9,10,11. 관류 탈세포화 기술을 사용하여 무세포 조직을 얻기 위한 효과적인 프로토콜을 개발함으로써 광범위한 조직 유형을 설계할 수 있습니다. 차례로,이 기술을 기반으로 더 복잡한 조직에 적용 할 수 있습니다. 현재까지, 혈관화된 연조직의 관류 탈세포화는 설치류¹², 돼지 13, 및 인간 모델⁽¹⁴) 뿐만 아니라 돼지 직장 복부 골격근¹⁵에서의 전층 근막 피판과 같은 단순 혈관화된 조직을 사용하여 조사되었다. 추가적으로, 복잡한 혈관화된 조직은 또한 돼지 및 인간의 귀^모델(16,17) 및 인간 전면-얼굴 이식 모델⁽¹⁸)에서 입증된 바와 같이 관류 탈세포화되었다.

여기서, 프로토콜은 생물학적으로 유도 된 ECM 스캐 폴드를 사용하여 혈관 화 된 자유 플랩의 탈 세포 화를 설명합니다. 우리는 임상적으로 관련된 세 가지 플랩의 탈세포화를 제시합니다: 1) omentum, 2) tensor fascia lata 및 3) 방사형 팔뚝, 모두 재건 수술에서 일상적으로 사용되는 일꾼 플랩을 대표하며 조직 탈세포화의 맥락에서 동물 연구에서 이전에 조사되지 않았습니다. 이 생체 공학 플랩은 대규모 연조직 결함 복구 및 재건 분야에서 사용하기 위한 임상 응용 가능성이 있는 다재다능하고 쉽게 사용할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

동물 피험자와 관련된 모든 절차는 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 대학 건강 네트워크 동물 자원 센터 프로토콜 및 절차 및 캐나다 동물 관리 지침위원회에 따라 수행됩니다. 5 마리의 요크셔 돼지 (35-50 kg, 약 12 주령)가 모든 실험에 사용되었습니다.

1. 관류 생물 반응기 제작

1. 관류 바이오리액터에 사용되는 모든 성분에 대해서는 도 1 을 참조한다. 티슈 챔버를 제조하려면 실리콘 씰 라이닝이 포함된 방수 및 밀폐 뚜껑이 있는 시판되는 폴리프로필렌 스냅 잠금 용기를 사용하십시오. 컨테이너가 오토클레이브와 호환되는지 확인하십시오.
2. 용기 측면을 따라 두 개의 1/4 구멍을 뚫고 L/S-16 백금 코팅 실리콘 튜브의 짧은 부분을 끼웁니다. 하나의 튜브는 유입 관류를 운반하고 다른 하나는 유출용입니다.
3. 유입 튜브의 경우 조직 캐뉼러에 연결하는 데 사용할 내부 부분에 수 Luer 커넥터를 부착합니다. 3방향 스톱콕에 연결하는 데 사용할 유입 튜브의 외부 끝에 암 Luer 커넥터를 부착합니다.
4. 챔버 덮개에 단일 1/4인치 구멍을 뚫고 L/S-16 백금 코팅 실리콘 튜브의 다른 짧은 부분을 끼웁니다. 이 튜브는 통풍구 역할을합니다.
5. L/S-50 백금 코팅 실리콘 튜브의 약 16cm를 측정하여 유입 및 유출 튜브를 만드십시오. 한쪽 끝을 노란색 3스톱 펌프 튜브에 연결하고 다른 쪽 끝을 멸균 2mL 혈청학적 피펫에 연결하여 세제 저장소에서 바이오리액터 챔버로 향수를 운반합니다.
6. 모든 구성 요소 (챔버 및 튜브)를 개별 포장 된 멸균 포장으로 오토 클레이브하십시오.

그림 1: 관류 바이오리액터의 제작. 관류 생물 반응기는 (A) 공기 및 방수 뚜껑이있는 관류 튜브를 수용하도록 뚫린 측면 구멍이있는 플라스틱 폴리 프로필렌 조직 챔버 (B)로 구성됩니다. (C) 스톱콕은 세제 저장소에서 단일 패스 방식으로 폐기물로 탈세포화제를 운반하는 관류 튜브를 부착할 수 있도록 튜브에 부착됩니다. (D) 호환 펌프 카세트는 3스톱 튜브를 연동 펌프에 연결하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 탈세포화 용액의 제조

1. 100 mL의 일반 식염수에 1000 IU / mL 헤파린 원액 1.5 mL를 희석하여 헤파린 화 된 일반 식염수 용액 (15 IU / mL)을 준비합니다.
2. 오토클레이브 증류수 18L에 SDS 분말 9g을 천천히 첨가하여 0.05% w/v 도데실 황산나트륨(SDS) 용액을 준비합니다. SDS 솔루션을 수용하기 위해 대용량 폴리프로필렌(PP) 카보이를 사용하십시오. 용액은 완전히 용해되면 사용할 수 있습니다. 실온에서 보관하십시오.
3. DNase I 작업 솔루션을 준비하십시오. 먼저, 동결건조된 DNase I을 멸균_dH2O에서 5mM_CaCl2로 10mg/mL의 스톡 농도로 재구성하고, 재구성된 스톡 DNase I 용액을 사용할 준비가 될 때까지 -20°C 냉동고에 분취액으로서 저장한다. 사용 당일에, DNase I 스톡 1:100을 멸균_dH2O에서 Mg++(1.29mM) 및 Ca⁺⁺(1.98mM)로 최종 농도 0.1mg/mL로 희석한다.
   참고: DNase 활성은 냉동 보관하지 않는 한 저하됩니다. 실온에서 DNA의 효소 소화를 위해 신선한 작동 DNase 용액 만 사용해야합니다.
4. PP 카보이에서 5L 최종 부피의 멸균 오토클레이브 물로 10x PBS 스톡 1:10을 희석하여 1x PBS 용액을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
5. PBS에 1% 항생제/항균제(A/A)를 준비합니다. 100x 항생제/항균제를 멸균 1x PBS 용액으로 1:100으로 최종 부피 1L로 희석합니다. 실온에서 보관하십시오.
6. 3.13mL의 PAA + 40mL의 100% 에탄올 + 956mL의 멸균_dH2O를 추가하여 0.1%(v/v) 과초산(PAA)/4%(v/v) 에탄올(EtOH)을 준비합니다. 최종 부피를 1,000mL로 가져오고 실온에서 보관하십시오.

3. 돼지 플랩 조달

참고: 이것은 터미널 절차입니다. 돼지 한 마리가 세 개의 플랩을 모두 조달하는 데 사용되었습니다. 모든 플랩을 조달 한 후 동물을 인도적으로 안락사시킵니다.

1. 수술 전 관리
   1. 수술 최소 12 시간 전에 빠른 돼지. 케타민 (20 mg / kg 근육 내, IM), 아트로핀 (0.04 mg / kg IM) 및 미다 졸람 (0.3 mg / kg IM)으로 동물을 진정시킨다.
   2. 주변 라인 삽입 및 삽관을 위해 22-44mL/kg/min의 유속으로 마스크를 통해 5% 이소플루란을 흡입하여 마취를 유도합니다. 22-44 mL / kg / min에서 0.5 % -2 % 이소 플루 란으로 마취를 유지하십시오. 혈역학적 안정성을 확인하여 적절한 마취 깊이를 보장하고 적절한 마취제 투여 수준을 나타내기 위해 눈꺼풀/페달 금단 반사 또는 턱 근육 긴장도가 없는지 확인합니다. 진통제 수술 중 정맥 내 레미 펜타닐 (10-20 μg / kg / h) 연속 속도 주입을 투여하십시오.
   3. 적절한 기관 내 튜브 (7-8mm)로 돼지를 삽관하고 튜브를 8mL / kg의 일회 호흡량, 5cm H 2 0의 PEEP, 0.5의 FiO₂ 및 14의 호흡수로 설정된인공 호흡기에 연결합니다.
   4. 22G 안지오카스 카테터를 귀 정맥에 삽입합니다. 정맥 주사(IV) 접근이 이루어지면 시술 전반에 걸쳐 5-10mL/kg/h의 따뜻한 0.9% 생리식염수를 주입하여 평균 동맥압을 60mmHg에서 90mmHg 사이로 유지합니다.
   5. 심박수, 맥박 산소 측정법 및 호기말_CO2를 지속적으로 모니터링합니다. 5 분마다 혈압과 체온을 평가하십시오.
   6. 마취 상태에서 안구 건조를 예방하기 위해 눈 연고를 바르십시오. 포비돈 요오드로 전체 수술 분야를 준비하십시오. 멸균 수건으로 수술 부위를 감싸십시오.
2. 오멘탈 플랩
   1. 돼지를 앙와위 자세에 놓고 xypho - 배꼽 개복술을 시행하십시오.
   2. 복부에 들어가면 위 cephalad를 동원하여 더 큰 omentum을 시각화하십시오. omentum을 수술 필드에 조심스럽게 배치하고 위의 더 큰 곡률을 따라 움직이는 위장 - 간질 혈관을 확인하십시오 (그림 2A).
   3. 왼쪽 위장-간질 동맥이 비장 동맥에 합류하는 더 큰 곡률의 왼쪽에서 시작합니다. 직선 Stevens tenotomy 가위를 사용하여 왼쪽 위 간질 동맥과 정맥을 모두 골격화합니다. 그런 다음 수술용 넥타이 또는 클립을 사용하여 둘 다 별도로 나눕니다.
   4. 왼쪽에서 오른쪽으로 위의 더 큰 곡률을 따라 진행하십시오. 위의 더 큰 곡률을 공급하는 omentum에서 발생하는 짧은 혈관 가지를 결지하고 나눕니다. 이 단계에서 omentum의 주요 위 배체 척추를 손상시키지 않도록주의하십시오.
   5. 오른쪽 위장 - 간질 혈관과 위 십이지장 동맥의 교차점이 발생할 때까지 더 큰 omentum의 동원을 계속하십시오. 클립이나 넥타이를 사용하여 오른쪽 위 상피 동맥과 정맥을 별도로 나누어 omental 플랩을 자유롭게합니다.
   6. 일단 해방되면, omentum은 중간을 따라 두 개의 반쪽으로 나눌 수 있으며, 각 반쪽에는 각각의 위장 - 상피 동맥과 정맥이 동반됩니다. 이를 통해 한 마리의 동물 작업에서 두 개의 omental free 플랩을 조달 할 수 있습니다. 20-22G 캐뉼라로 위장 혈관을 개별적으로 캐뉼러 한 다음 3-0 실크 타이로 고정합니다.
   7. 명확한 정맥 유출이 관찰 될 때까지 헤파린 화 된 식염수 (15 I.U. / mL)를 위장 - 상피 성 동맥 캐뉼라로 플러시합니다.
3. 텐서 근막 라타 플랩
   참고: 이 프로토콜은 Haughey et ^al.19의 돼지 텐서 근막 라타 플랩에 대한 이전 설명을 기반으로 합니다. 텐서 근막 라타 플랩의 근막 부분 만 분리하도록 수정이 이루어집니다.
   1. 돼지를 측면 욕창 위치에 놓고 뒷다리 전체를 양측으로 면도하십시오. 일반적인 멸균 절차를 사용하여 준비하고 드레이프하십시오.
   2. 전방 장골 척추 (ASIS)에서 측면 슬개골쪽으로 연장되는 선으로 플랩의 앞쪽 경계를 표시하십시오. 척추의 위치는이 선을 따라 ASIS에서 약 6-8cm입니다.
   3. 플랩의 너비를 포함하도록 대퇴골의 축을 따라 전방 절개에서 약 8cm에서 10cm 떨어진 평행 한 후방 선을 표시하십시오. 측면 슬개골에서 플랩의 말단 가장자리를 표시하십시오.
   4. 메스를 사용하여 피부를 날카롭게 절개하여 슬개골의 말단 가장자리에서 해부를 시작하십시오. 대퇴직근 위에 있는 근막이 마주칠 때까지 피하 조직을 통해 소작으로 피부 절개를 심화시킵니다.
   5. 위에서 설명한 표시된 전방 및 후방 경계를 따라 ASIS쪽으로 피부 절개를 계속하십시오. 근막 플랩 만 분리하려면 밑에있는 근막 층에서 위에있는 피부 구성 요소를 제거하십시오. 피부에 작은 천공기 혈관을 결지하거나 소작하십시오.
   6. 플랩의 말단 경계로 돌아가서 깊은 근막을 절개하여 밑에있는 광대 한 측면 근육의 동원을 허용합니다. ASIS쪽으로 근막을 동원하십시오.
   7. 동원하는 동안 광대 한 외측 근육과 직근 대퇴근 사이에서 나오는 혈관 척추를 확인하십시오 (그림 2B). 척추 혈관이 손상되지 않도록 과도한 견인을 피하도록주의하십시오.
   8. 혈관 척추를 보호하면서 ASIS에서 근위부를 해부합니다. 플랩이 척추에 대해 충분히 동원 될 때까지 해부하십시오.
   9. 척추를 깊은 대퇴 혈관쪽으로 추적하십시오. 측면 circumflex 대퇴 동맥과 근막 피판을 공급하는 정맥을 모두 골격화하십시오. 그런 다음 Ligate는 두 혈관을 근위로 나누어 깊은 대퇴 혈관에 합류합니다.
   10. 척추경 혈관을 20-24G 혈관카테터로 개별적으로 캐뉼러하고 3-0 실크 타이로 고정합니다. 명확한 정맥 유출이 관찰 될 때까지 헤파린 화 된 식염수 (15 I.U. / mL)를 플랩 동맥 캐뉼라로 플러시합니다.
4. 방사형 팔뚝 플랩
   참고: 아래 프로토콜은 Khachatryan et ^al.20의 돼지 방사형 팔뚝 플랩 모델에 대한 게시된 설명을 기반으로 합니다.
   1. 돼지를 수술대 위의 측면 욕창 위치에 놓습니다. 수술 필드 내에 종속 앞다리를 배치하십시오.
   2. 방사형 팔뚝에 대략 3cm x 3cm의 스킨 플랩 사각형을 표시하십시오. 근위 플랩 마진의 중간 점과 전방 포사 사이에 선을 그려 요골 동맥 척추의 대략적인 경로를 나타냅니다. 촉진으로 동맥 경로를 확인하십시오.
      참고: 돼지 모델에서 방사형 용기는 인간보다 상대적으로 더 깊게 위치합니다. 그들의 위치는 굴곡근 carpi radialis와 brachioradialis 사이에 있습니다.
   3. 상완 전 근막까지 깊이가있는 원위부에서 메스를 사용하여 피부를 절개하십시오. 원위 요골 동맥과 두 개의 정맥 comitantes가 만날 때까지 tenotomy 가위로 둔하게 해부하십시오. 외과 적 넥타이로 동맥과 정맥을 개별적으로 결찰하고 나눕니다.
   4. 표시된 피부 사각형의 방사형 및 척골 가장자리에서 피부 절개를 계속하십시오. 반경 방향에서 척골 방향으로 진행되는 수술 블레이드로 밑에있는 방사형 뼈에서 플랩을 동원하는 동시에 피부 플랩을 앞쪽 포사쪽으로 근위로 올립니다.
      알림: 요골 동맥 척추경이 위에 놓인 피부층과 연결되어 있는지 확인하기 위해 근막하 박리면을 유지하십시오.
   5. 근위 가장자리에서 자체 유지 견인기로 상완골과 굴곡근 카르피 요골 사이의 공간을 수축시켜 근위 요골 동맥과 그 대정맥을 노출시킵니다(그림 2C).
   6. tenotomy 가위를 사용하여 요골 동맥과 정맥을 각각 상완 동맥과 정맥에 연결하는 전방 포사에서 근위부로 골격화합니다. 약 5-6cm의 충분한 척추 길이를 얻기 위해 주변 섬유 지방 조직에서 혈관을 해부하십시오. 동맥과 정맥을 별도로 결박하고 나누어 방사형 팔뚝 플랩을 자유롭게합니다.
   7. 척추경 혈관을 20-24G 혈관 카테터로 캐뉼러하고 3-0 실크 타이로 고정합니다. 명확한 정맥 유출이 관찰 될 때까지 헤파린 화 된 식염수 (15 IU / mL)를 플랩 동맥 캐뉼라로 플러시합니다.
   8. 플랩 조달 후 탈세포화 준비가 될 때까지 플랩을 4°C의 차가운 식염수에 보관하십시오. 깊은 이소 플루 란 마취하에 염화칼륨 (100 mg / kg IV)의 정맥 주사로 동물을 안락사시킨다. 활력 징후가 없어 사망을 확인하십시오.

그림 2 : 3 개의 돼지 혈관 플랩 조달. (A) 오멘텀. 오른쪽 (i) 및 왼쪽 (ii) 위 상피 배체 동맥은 omental 플랩 (iii)에서 캐뉼러됩니다. (B) 텐서 근막 라타. 플랩의 척추 (iv)는 측면 대퇴 곡절 동맥 (v)의 오름차순 가지입니다. (C) 방사형 팔뚝 플랩. 방사형 팔뚝 플랩(vi)의 조달은 요골 동맥과 대정맥(vii)을 혈관 척추경으로 기반으로 합니다(참고: 드레이프는 시연 목적으로 생략됨). 스케일 바: 3 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 탈세포화 시스템 설정

1. 층류 생물 안전 캐비닛에서 멸균 조건에서 플랩으로 조직 챔버를 조립하십시오.
2. 생물 반응기의 유입 및 유출 포트 모두에 3 방향 스톱 콕을 부착하십시오. 0.2μm 필터를 티슈실 뚜껑의 공기 배출구에 부착합니다. 유입 튜브를 멸균 헤파린화 식염수로 프라이밍하여 기포를 제거합니다.
3. 플랩을 챔버에 놓습니다. 멸균 지혈기를 사용하여 수 Luer 커넥터를 사용하여 플랩을 유입 튜브에 연결합니다. 각 플랩의 각 동맥 캐뉼러를 수컷 루어에 나사로 고정하고 단단히 밀봉하십시오.
4. 스톱 콕을 통해 헤파린 화 된 식염수를 세척하여 Luer 연결에 누출이없고 플랩이 정맥 유출의 증거로 관류 될 수 있는지 확인하십시오. 티슈 챔버 뚜껑을 닫습니다.
5. 노란색 3스톱 펌프 튜브가 있는 유입 튜브를 조직 챔버의 유입 스톱콕에 연결합니다. 또한 인라인 압력 센서 변환기를 유입 3방향 스톱콕에 부착하여 관류 압력 모니터링이 가능합니다.
6. 유입 연동 펌프를 켭니다. 초기 화면에서 화살표 키를 사용하여 세 번째 탭으로 이동하여 튜브 ID를 1.85mm로 설정합니다. 그런 다음 두 번째 탭으로 진행하여 관류 속도를 설정하십시오. 입력 속도를 전달 모드로 설정하고 2mL/분으로 설정합니다. 화면에 표시된 대로 흐름 방향이 올바른지 확인합니다. 3스톱 펌프 튜브를 호환 가능한 카세트로 연동 펌프에 로드합니다.
7. 위와 유사한 유출 연동 펌프에 대해 절차를 반복하십시오. 유출 펌프 설정을 4mL/분의 속도로 설정합니다. 노란색 3스톱 펌프 튜브가 있는 유출 튜브를 조직 챔버의 유출 스톱콕에 연결합니다. 3스톱 펌프 튜브를 호환 가능한 카세트로 연동 펌프에 로드합니다. 전원 버튼을 눌러 두 펌프의 흐름을 시작합니다.
   알림: 유출 펌프의 더 높은 속도는 조직 챔버의 오버플로를 방지하는 중요한 안전 조치이며, 탈세포화 과정에서 챔버 유출이 항상 유입을 초과하도록 합니다. 조립된 전체 탈세포화 설정은 그림 3에 나와 있습니다.

그림 3: 조립된 관류 탈세포화 시스템 . (A) 관류 탈세포화 시스템의 개략도. 유입 튜브는 압력 센서 모니터링을 통해 단일 패스 방식으로 세제 저장소에서 조직 챔버로 향수를 운반합니다. 유출 튜브는 조직 챔버에서 폐기물 용기로 향수를 적극적으로 제거합니다. 검은 색 화살표는 관류 흐름의 방향을 나타냅니다. 연동 펌프는 왼쪽 펌프와 함께 사용되어 유입을 제어합니다. 유출은 각각의 튜브를 통해 제 2 연동 펌프를 사용하여 능동적으로 제거됩니다. BioRender.com 로 만든 그림입니다. (B) 유입 연동 펌프 (i)가 조직 챔버 (ii)에 연결된 다음 유출 연동 펌프 (iii)로 벤치 탑에 조립 된 관류 탈세포 화 시스템의 사진. 유입 관류 압력은 조직 챔버에 들어가기 전에 인라인 압력 센서(iv)로 모니터링됩니다. 여기서 세 개의 플랩이 병렬로 탈세포화됩니다. 세제와 폐기물 저장통은 모두 벤치탑 아래에 있으며 사진이 찍히지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 돼지 플랩의 탈세포화

1. 실온에서 관류 탈세포화를 위해 다음 단계를 모두 수행하십시오. 관류 속도 및 지속 시간에 대한 요약은 표 1을 참조하십시오. 연동 펌프를 사용하여 2mL/min의 헤파린화된 식염수의 관류를 시작하고 조직 챔버에서 헤파린화된 식염수로 플랩을 15분 동안 관류하여 남아 있는 혈전을 제거합니다.
2. 헤파린화 식염수 관류가 완료되면, 조직 챔버에서 잔류 식염수를 흡인한다. 플랩이 충분히 잠길 수 있도록 약 500mL의 SDS 탈세포화 용액으로 조직 챔버를 채웁니다.
3. 유입 튜브를 SDS 탈세포화 용액으로 옮기고 조직을 2mL/min으로 관류합니다. 관류 기간은 플랩에 따라 다릅니다. 망막의 경우 2일, 텐서 근막의 경우 3일, 방사형 팔뚝 근막-피부 피판의 경우 5일 동안 SDS를 관류합니다.
4. SDS 탈세포화가 완료되면, 조직 챔버 내에 포함된 기존의 SDS 관류물을 흡인한다. 유입 튜브를 1x PBS 용액으로 옮기고 플랩을 2mL/분으로 1일 동안 관류합니다.
5. 이전 PBS 용액을 제거하고 유입 튜브를 DNase 작업 용액으로 옮깁니다. 2mL/분으로 2시간 동안 관류합니다. 조직 챔버에서 DNase 용액을 제거하고 유입 튜브를 1x PBS 용액에 넣습니다. 조직을 챔버에 1x PBS 용액으로 담그고 1x PBS 용액을 2mL/분으로 1일 동안 관류합니다.
6. PAA/EtOH 용액으로 플랩을 소독합니다. 유입 튜브를 dH₂O 용액의 PAA / EtOH로 옮기고 조직을 동일한 용액에 담그십시오. PAA/EtOH를 분당 2mL로 3시간 동안 관류합니다. PAA/EtOH 멸균이 완료되면 3방향 스톱콕에서 튜브를 분리합니다.
7. 무균 기술을 사용하여 플랩을 제거하고 멸균 기구를 1% 항생제/항균제(A/A)가 포함된 PBS에 넣습니다. 플랩을 PBS + 1% A/A로 15분 동안 두 번의 별도 세척에 담그면 잔류 산이 완전히 중화됩니다. 재셀룰러화 준비가 될 때까지 플랩을 4°C에서 PBS + 1% A/A에 유지합니다.
8. 한천 플레이트에서 면봉 배양을 수행하여 스캐폴드의 무균 상태를 확인하고 미생물 성장을 검사합니다. 각 플랩 표면에서 채취한 면봉으로 한천 플레이트를 접종합니다. 한천 플레이트를 37°C에서 최대 2주 동안 배양한다. 불임은 미생물 콜로니 성장의 부재로 입증됩니다.

표 1: 관류-탈세포화 프로토콜 매개변수의 요약. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

6. 탈세포화 평가

1. 펀치 생검을 사용하여 플랩에서 3mm에서 10mm 두께의 샘플을 조달합니다.
2. 조직학의 경우 실온에서 24 시간 동안 정상 완충 포르말린의 조직 학적 카세트에서 생검을 고정하십시오.
3. 생검 카세트를 물이나 PBS로 15분 동안 씻은 다음 조직 처리 준비가 될 때까지 70% 에탄올에 넣습니다. 표준 프로토콜에 따라 티슈 프로세서에서 카세트를 처리하십시오.
4. 생검을 파라핀에 삽입하여 왁스가 냉각판에서 10-15분 동안 응고되도록 합니다. 파라핀 절편 마이크로톰 상의 블록은 5 μm 두께이다. 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린과 에오신 (H&E)으로 슬라이드를 염색합니다. 광학 현미경으로 조직 슬라이드를 이미지화합니다.
5. DNA 함량 정량화를 위해, 60°C의 오븐에서 밤새 조직 건조에 따른 조직 생검의 건조 중량을 얻는다. 샘플을 파파인 추출 완충액에서 65°C에서 밤새 분해한다. 10,000 x g 에서 분해된 샘플을 원심분리하고 상청액을 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 상업용 DNA 추출 키트로 DNA 함량을 분석합니다.

혈관화된 돼지 플랩을 탈세포화하는 이 프로토콜은 맞춤형 관류 바이오리액터에서 플랩 혈관구조를 통한 이온계 세제 SDS의 관류에 의존합니다. 탈세포화 이전에는 돼지 모델에서 3개의 혈관화된 플랩을 조달하고 주 공급 용기에 따라 캐뉼러링했습니다. 플랩은 성공적인 탈세포화를 허용하기 위해 특허, 관류 가능한 혈관구조를 유지하기 위해 조달 후 즉시 플러싱되었습니다. 밀폐 된 스냅 뚜껑 용기를 사용하여 밀폐 된 환경 내에서 플랩 관류를 허용하도록 맞춤형 생물 반응기를 설계했습니다. 바이오리액터 내의 플랩의 관류는 조직 챔버에 연결된 2개의 연동 펌프를 사용하여 단일 패스 방식으로 달성되었습니다. 관류 압력은 인라인 압력 센서로 모니터링되었습니다.

탈세포화 동안, SDS 노출 기간은 처리되는 조직의 유형에 의존하였다. 기술된 관류 탈세포화 기술을 사용하여, 오멘텀, 텐서 근막 및 방사형 팔뚝 플랩을 각각 2일, 3일 및 5일 동안 0.05% SDS로 탈세포화하였다. 탈세포화 후 성공적인 살균은 플랩을 면봉으로 닦고 14일 동안 한천 플레이트에서 면봉을 배양한 후 미생물 콜로니 성장이 없는 것으로 입증되었습니다. 관류 압력은 2mL/min 유속으로 모니터링되었으며 3개의 플랩 모두에 대한 탈세포화의 모든 단계에서 20-60mmHg 범위였습니다. 탈세포화가 끝나면 플랩을 수동 제어로 세척하고 정맥 캐뉼라에서 자유 배액으로 유출되는 증거를 입증했습니다(보충 비디오 1, 보충 비디오 2, 보충 비디오 3).

총 15개의 플랩이 탈세포화되었으며, 3가지 조직 유형 각각에 대해 5개의 복제가 이루어졌습니다. 검사에서 네이티브 조직의 총 형태는 분홍색으로 나타난 반면(그림 4A, E, I), 탈세포화된 조직은 특징적으로 흰색/불투명했습니다(그림 4C, G, K). H & E를 사용한 원시 조직의 조직 학적 검사는 청색 핵의 존재를 보여줍니다 (그림 4B, F, J). 탈세포화된 플랩에서 H&E 염색은 청색 핵 염색이 없는 상태에서 세포 물질의 손실을 보여주었으며(그림 4D, H, L), 이는 무세포 조직 스캐폴드를 나타냅니다. 5 번의 반복에서 DNA 함량의 추가 정량화는 각 플랩에 대한 스튜던트 t- 테스트에 의해 네이티브 조직과 비교하여 무세포 스캐 폴드의 DNA가 통계적으로 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다 (그림 5). omentum에서 DNA는 기본 플랩의 460ng/mg ± 124ng/mg 건조 조직에서 탈세포화된 플랩의 5.90ng/mg 건조 조직 ± 25.8ng/mg으로 감소했습니다(n = 5, p < 0.05). 텐서 근막 라타에서 DNA는 네이티브 플랩과 탈세포 플랩 사이에서 각각 297 ng/mg± 68.2 ng/mg에서 58.3 ng/mg ± 13.5 ng/mg으로 감소했습니다(n=5, p < 0.05). 방사형 팔뚝 플랩은 기본 플랩에서 1180ng/mg ± 241ng/mg에서 탈세포화된 플랩에서 162ng/mg ± 34.9ng/mg으로 DNA 감소를 보였습니다(n=5, p < 0.05).

그림 4: 3개의 돼지 플랩의 탈세포화. (A) 네이티브 오멘텀, (E) 텐서 근막 라타 및 (I) 방사형 팔뚝 플랩의 전체 검사는 조달 직후 플랩의 분홍색 모양을 보여줍니다. 천연 조직의 조직학적 염색은 H&E(B,F,J)를 사용한 세포핵의 명확한 헤마톡실린 염색을 입증합니다. 탈세포화 후 (C) omentum, (G) 텐서 근막 라타 및 (K) 방사형 팔뚝이 심하게 하얗고 불투명하게 보입니다. 조직 학적으로, 3 개의 탈 세포 화 된 플랩은 H & E (D, H, L)로 핵 염색이 없음을 보여줍니다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 무세포 스캐폴드의 DNA 함량 정량화. 값은 건조 스캐폴드 질량의 mg으로 정규화됩니다. 천연의 탈세포화된 조직(n=5) 및 탈세포화된 조직(n=5)으로부터의 신선한 조직 샘플을 정량화 전에 파파인에서 밤새 소화하기 전에 건조시키고 칭량하였다. 통계적 검정에서는 p-값 < 0.05로 정의된 유의(**) 수준의 스튜던트 t-검정을 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1. 총 검사 (스케일 바 = 3cm) 및 H & E 조직학 (스케일 바 = 200 μm)에 의해 5 일 동안 0.05 % 나트륨 도데 실 설페이트를 사용하여 omentum의 관류 - 탈 세포화 진행에 대한 시간 경과 검사. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2. 총 검사 (스케일 바 = 3cm) 및 H & E 조직학 (스케일 바 = 200 μm)에 의해 5 일 동안 0.05 % 나트륨 도데 실 설페이트를 사용하는 텐서 근막 라타의 관류 - 탈세포 화의 진행에 대한 시간 경과 검사. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3. 총 검사 (스케일 바 = 3cm) 및 H & E 조직학 (스케일 바 = 200 μm)에 의해 5 일 동안 0.05 % 나트륨 도데 실 설페이트를 사용하여 방사형 팔뚝 플랩의 관류 진행에 대한 시간 경과 검사. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 1. 동맥 캐뉼라(분홍색)를 통한 탈세포화된 오멘텀 플랩의 대표적인 수동 관류는 자유롭게 배수되는 정맥 캐뉼라(노란색)로부터의 유출을 보여줍니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 2. 동맥 캐뉼라(분홍색)를 통한 탈세포화된 텐서 근막 라타 플랩의 대표적인 수동 관류는 자유롭게 배수되는 정맥 캐뉼라(파란색)에서 유출을 보여줍니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 3. 동맥 캐뉼라(파란색)를 통한 탈세포화된 방사형 팔뚝 플랩의 대표적인 수동 관류는 자유롭게 배수되는 정맥 캐뉼라(노란색)로부터의 유출을 보여줍니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.